斑马鱼UCP2基因敲除模型的建立及铝毒性的初步研究
发布时间：2021-06-27 06:30
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是以学习记忆障碍为特征的一种年龄相关的神经退行性疾病。其病理特征为脑内β-淀粉样蛋白沉积形成的老年斑（Senile plaques,SP）、神经细胞内神经元纤维缠结（Neurofibrillary tangles,NFTs）和神经元数量减少等。随着世界老龄化的日趋严重,其发病率逐步增加。AD已严重影响着人类健康,给患者及其家庭带来巨大的痛苦和经济负担。目前,AD的发病机制依然没有明确,需要进一步深入探索。本研究则是利用斑马鱼铝模型筛选出线粒体相关易感基因UCP2,通过CRISPR/Cas9系统构建了UCP2基因敲除的斑马鱼模型,再以该模型初步研究UCP2在铝致痴呆中的作用。具体研究内容和结果如下:1、建立斑马鱼铝暴露模型并筛选线粒体相关易感基因将野生型斑马鱼成鱼暴露于酸性氯化铝（pH 5.8,100μg/L AlCl3）40天,通过T迷宫测试其行为学变化,RT-qPCR筛选出与线粒体功能相关的易感基因。与空白对照组相比,AlCl3暴露组的斑马鱼进入富集区的时间延长（P<0.01...
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas9基因敲除系统工作原理图
处于烧杯中）。具体步骤按照蒲韵竹[34]等实验方案进行，斑马鱼分组次放置 T 迷宫中自由游动 2 h，使其适应 T 迷开始测试，将斑马鱼用渔捞小心放入起始区，利用监测系统始点到进入EC区的时间（潜伏期），每条斑马鱼的测试总时准：要求每条斑马鱼必须进入 EC 区且停留时间大于 30 s的斑马鱼，皆在 EC 区给予食物奖赏；而没有进入 EC 区将其引入 EC 区，且停留 3 min，给予食物奖赏。测试后编号的容器中（单独培养），测试期间只能在 EC 区给予每天早上保证同一时间开始测试，记录其潜伏时间。
-△△Ct法进行计算。2 采用 CRISPR/Cas9 技术构建斑马鱼 UCP2 基因敲除模型实验2.1 CRISPR/Cas9 基因敲除靶位点设计通过Esembl网站查询斑马鱼UCP2的基因组DNA外显子序列及其功能区，按照SPR/Cas9系统设计原理进行UCP2基因敲除靶点的设计，通过网站The ZiFiTeter（http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx）上寻找一个合适UCP敲除靶点。基因靶点的设计原则为：结构须满足5'-GG-N18-NGG-3'。其中5'端的GG是T7启的一部分，是为了增加转录效率，设计基因敲除靶点时可以不考虑该因素，但3须满足PAM（即NGG）结构。其次，敲除靶点的选择必须保证靶点处的碱基序够发生改变（插入或者缺失），最好能够引起移码突变，这样就可以引起一系列酸发生改变，进而影响基因功能的表达。本实验所设敲除靶点位于UCP2基因的外显子上，刚好处于基因的功能区，并且所选靶点序列上存在特定BsmAI酶切位便于后期的敲除验证及筛选，如图5所示。
【参考文献】：
期刊论文
[1]22种山茶科植物叶片铝含量及其亚细胞分布[J]. 渠心静,陈雪燕,戴生玉,袁军. 分子植物育种. 2018(03)
[2]绍兴地区食品中铝监测结果分析[J]. 马丹英,邢超,张炎艳,王晶,蒋兴祥. 预防医学. 2018(02)
[3]深圳市2015年市售茶叶中金属污染现况及健康风险评估[J]. 杨淋清,王舟,潘柳波,张慧敏,罗贤如,李思果,张锦周,黄薇. 中国热带医学. 2017(12)
[4]CRISPR/Cas9基因编辑技术在脑科学中的应用策略[J]. 张骑鹏,孙安阳. 科学通报. 2017(31)
[5]最新食品添加剂系列国家安全标准的变化[J]. 郜轩宇,臧英男,许静. 现代食品. 2017(19)
[6]2013-2016年济南市膳食食品中铝残留量监测及人群暴露评估[J]. 焦海涛,张鑫,杨晓倩,孙延斌,曹小丽,刘仲,刘素华. 现代预防医学. 2017(16)
[7]Role of Microtubule-associated Protein Tau Phosphorylation in Alzheimer’s Disease[J]. 马荣红,张瑶,洪小月,张俊菲,王建枝,刘恭平. Journal of Huazhong University of Science and Technology（Medical Sciences）. 2017(03)
[8]Effects of medicinal plants on Alzheimer’s disease and memory deficits[J]. Muhammad Akram,Allah Nawaz. Neural Regeneration Research. 2017(04)
[9]铝暴露对大鼠肝结构和功能的影响[J]. 潘丽娜,李艳飞. 现代畜牧科技. 2017(04)
[10]铝的危害与防治方法研究[J]. 李彩云. 广东化工. 2017(06)
博士论文
[1]氟中毒肾损伤时STC1、UCP2的表达与作用及高钙干预对其影响的机制研究[D]. 张永春.重庆医科大学 2012
硕士论文
[1]铝对大鼠成骨细胞矿化过程的影响[D]. 宋淼.东北农业大学 2014
[2]铝对斑马鱼学习记忆能力的影响及其相关机制初步研究[D]. 李春杰.西南大学 2014
[3]解耦联蛋白2对线粒体氧化损伤诱导端粒依赖性衰老的干预和机制[D]. 郭鑫.南昌大学医学院 2013
[4]斑马鱼阿尔茨海默病动物模型的建立[D]. 蒲韵竹.西南大学 2013
[5]线粒体解耦联蛋白2与抑郁症的相关性研究[D]. 吴芳芳.南京医科大学 2013
[6]线粒体解耦联蛋白2与帕金森病的相关性[D]. 刘洋.南京医科大学 2011
本文编号：3252326
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CRISPR/Cas9基因敲除系统工作原理图
处于烧杯中）。具体步骤按照蒲韵竹[34]等实验方案进行，斑马鱼分组次放置 T 迷宫中自由游动 2 h，使其适应 T 迷开始测试，将斑马鱼用渔捞小心放入起始区，利用监测系统始点到进入EC区的时间（潜伏期），每条斑马鱼的测试总时准：要求每条斑马鱼必须进入 EC 区且停留时间大于 30 s的斑马鱼，皆在 EC 区给予食物奖赏；而没有进入 EC 区将其引入 EC 区，且停留 3 min，给予食物奖赏。测试后编号的容器中（单独培养），测试期间只能在 EC 区给予每天早上保证同一时间开始测试，记录其潜伏时间。
-△△Ct法进行计算。2 采用 CRISPR/Cas9 技术构建斑马鱼 UCP2 基因敲除模型实验2.1 CRISPR/Cas9 基因敲除靶位点设计通过Esembl网站查询斑马鱼UCP2的基因组DNA外显子序列及其功能区，按照SPR/Cas9系统设计原理进行UCP2基因敲除靶点的设计，通过网站The ZiFiTeter（http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx）上寻找一个合适UCP敲除靶点。基因靶点的设计原则为：结构须满足5'-GG-N18-NGG-3'。其中5'端的GG是T7启的一部分，是为了增加转录效率，设计基因敲除靶点时可以不考虑该因素，但3须满足PAM（即NGG）结构。其次，敲除靶点的选择必须保证靶点处的碱基序够发生改变（插入或者缺失），最好能够引起移码突变，这样就可以引起一系列酸发生改变，进而影响基因功能的表达。本实验所设敲除靶点位于UCP2基因的外显子上，刚好处于基因的功能区，并且所选靶点序列上存在特定BsmAI酶切位便于后期的敲除验证及筛选，如图5所示。
【参考文献】：
期刊论文
[1]22种山茶科植物叶片铝含量及其亚细胞分布[J]. 渠心静,陈雪燕,戴生玉,袁军. 分子植物育种. 2018(03)
[2]绍兴地区食品中铝监测结果分析[J]. 马丹英,邢超,张炎艳,王晶,蒋兴祥. 预防医学. 2018(02)
[3]深圳市2015年市售茶叶中金属污染现况及健康风险评估[J]. 杨淋清,王舟,潘柳波,张慧敏,罗贤如,李思果,张锦周,黄薇. 中国热带医学. 2017(12)
[4]CRISPR/Cas9基因编辑技术在脑科学中的应用策略[J]. 张骑鹏,孙安阳. 科学通报. 2017(31)
[5]最新食品添加剂系列国家安全标准的变化[J]. 郜轩宇,臧英男,许静. 现代食品. 2017(19)
[6]2013-2016年济南市膳食食品中铝残留量监测及人群暴露评估[J]. 焦海涛,张鑫,杨晓倩,孙延斌,曹小丽,刘仲,刘素华. 现代预防医学. 2017(16)
[7]Role of Microtubule-associated Protein Tau Phosphorylation in Alzheimer’s Disease[J]. 马荣红,张瑶,洪小月,张俊菲,王建枝,刘恭平. Journal of Huazhong University of Science and Technology（Medical Sciences）. 2017(03)
[8]Effects of medicinal plants on Alzheimer’s disease and memory deficits[J]. Muhammad Akram,Allah Nawaz. Neural Regeneration Research. 2017(04)
[9]铝暴露对大鼠肝结构和功能的影响[J]. 潘丽娜,李艳飞. 现代畜牧科技. 2017(04)
[10]铝的危害与防治方法研究[J]. 李彩云. 广东化工. 2017(06)
博士论文
[1]氟中毒肾损伤时STC1、UCP2的表达与作用及高钙干预对其影响的机制研究[D]. 张永春.重庆医科大学 2012
硕士论文
[1]铝对大鼠成骨细胞矿化过程的影响[D]. 宋淼.东北农业大学 2014
[2]铝对斑马鱼学习记忆能力的影响及其相关机制初步研究[D]. 李春杰.西南大学 2014
[3]解耦联蛋白2对线粒体氧化损伤诱导端粒依赖性衰老的干预和机制[D]. 郭鑫.南昌大学医学院 2013
[4]斑马鱼阿尔茨海默病动物模型的建立[D]. 蒲韵竹.西南大学 2013
[5]线粒体解耦联蛋白2与抑郁症的相关性研究[D]. 吴芳芳.南京医科大学 2013
[6]线粒体解耦联蛋白2与帕金森病的相关性[D]. 刘洋.南京医科大学 2011
本文编号：3252326
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