野生型和酶活缺失型人乙酰肝素酶慢病毒表达载体的构建及其验证

发布时间：2021-07-13 10:27

　　目的为构建野生型和酶活缺失型人乙酰肝素酶（HPA）的慢病毒表达载体,以探讨HPA的酶活性作用和非酶活性作用。方法根据GV358慢病毒质粒载体序列和HPA基因序列设计用于无缝克隆的引物,HPA的PCR扩增产物与线性化的GV358质粒载体连接,获得重组慢病毒质粒。将经测序验证的重组慢病毒质粒与包装质粒共转染HEK-293T细胞,收取病毒感染液并感染HEL细胞,利用Western印迹法鉴定HPA过表达效果;利用流式细胞术检测细胞表面硫酸乙酰肝素（HS）的表达量;利用ELISA检测多配体蛋白聚糖1（syndecan-1）的释放量,以验证野生型和酶活缺失型HPA慢病毒表达载体的生物学效应。结果重组慢病毒质粒测序结果符合预期;Western印迹法检测结果表明,过表达HPA的HEL细胞有明显的HPA蛋白表达;流式细胞术结果显示,过表达野生型HPA的HEL细胞表面HS表达量的几何平均荧光强度（160.0±8.0）明显低于空载体对照细胞（345.0±15.2）（P<0.01）;ELISA结果显示,过表达野生型HPA的HEL细胞培养基中多配体蛋白聚糖1的释放量（59.0±3.8）ng·L^-... 

【文章来源】：中国药理学与毒理学杂志. 2019,33(12)北大核心

【文章页数】：7 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 药物、试剂和仪器
    1.2 细胞、质粒和模板
    1.3 引物设计
    1.4 定点突变
    1.5 野生型和酶活缺失型HPSE慢病毒质粒载体的构建
    1.6 慢病毒包装
    1.7 稳转细胞株构建
    1.8 Western印迹法检测HPA过表达效果
    1.9 过表达野生型/酶活缺失型HPA的HEL细胞中HPA酶活性的比较
        1.9.1 流式细胞术检测细胞表面HS表达量的变化
        1.9.2 ELISA法检测细胞培养基中多配体蛋白聚糖1的释放量
    1.1 0 统计学分析
2 结果
    2.1 野生型和酶活缺失型的HPA慢病毒质粒载体的验证
    2.2 稳定过表达野生型和酶活缺失型HPA的HEL细胞系的建立
    2.3 过表达野生型和酶活缺失型HPA的HEL细胞中HPA酶活性的比较
3 讨论



本文编号：3281892