EGFR/MDM2信号通过PPARγ降解途径促进NFκB激活

发布时间：2021-07-17 08:07

　　表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）属于酪氨酸激酶受体,它通过激活下游信号蛋白调节细胞的生长、增殖。由于EGFR在多种恶性肿瘤组织中异常表达或突变,因此EGFR也是肿瘤治疗的重要靶点,但EGFR在肿瘤发生、发展过程中的具体作用尚不完全清楚。此外,过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ）是一类核激素受体,广泛参与糖尿病、动脉粥样硬化、炎症、癌症等病理生理过程并发挥重要作用。PPARγ能通过抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及促进凋亡等途径发挥抗肿瘤效应。我们之前的研究鉴定了PPARγ具有E3泛素连接酶的功能,前者通过与NFκB/p65相互作用,诱导p65蛋白泛素化、降解,从而终止NFκB介导的炎症、肿瘤发生。然而,EGFR与PPARγ相互关系机制依然不清楚。此外,EGFR/PPARγ/NFκB信号轴如何发挥作用机制仍然不明。在本研究中,我们发现激活的EGFR发生细胞核转位,从而磷酸化PPARγ-Y74位点,并招募泛素化连接酶MDM2将PPARγ泛... 

【文章来源】：江苏大学江苏省

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 PPARγ
        1.1.1 PPARγ概述
        1.1.2 PPARγ及其配体与肿瘤
        1.1.3 PPARγ作为泛素化连接酶的生物学功能
    1.2 EGFR
        1.2.1 EGFR概述
        1.2.2 细胞核内EGFR
        1.2.3 细胞核内EGFR与肿瘤治疗
    1.3 MDM2(murine double minute2)
        1.3.1 MDM2概述
        1.3.2 MDM2的生理功能
    1.4 本研究的意义
    1.5 主要研究内容和技术路线
        1.5.1 主要研究内容
        1.5.2 技术路线
第二章 EGFR诱导PPARγ-Y74磷酸化
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞系
        2.1.2 实验动物
        2.1.3 实验试剂
        2.1.4 实验仪器和设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 细胞培养
        2.2.2 细胞总蛋白样品的制备
        2.2.3 细胞总蛋白浓度测定
        2.2.4 细胞质和细胞核的分离
        2.2.5 Western Blot检测
        2.2.6 抗体制备
        2.2.7 PPARγ原核表达载体的构建
        2.2.8 PPARγ-Y74A原核表达载体的构建：点突变
        2.2.9 GST-PPARγ和GST-PPARγ-Y74A蛋白的表达与纯化
        2.2.10 磷酸化位点预测
        2.2.11 体外磷酸化
    2.3 实验结果与分析
        2.3.1 细胞核EGFR与PPARγ的相互关系
        2.3.2 软件预测PPARγ可能的磷酸化位点
        2.3.3 体外磷酸化验证PPARγ磷酸化位点
        2.3.4 EGFR调节PPARγ-Y74磷酸化
    2.4 本章小结
第三章 PPARγ-Y74A突变体抑制EGFR/MDM2信号介导的PPARγ 降解
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验细胞系
        3.1.2 实验试剂
        3.1.3 实验仪器与设备
    3.2.实验方法
        3.2.1 细胞转染（以96孔板为例）
        3.2.2 免疫共沉淀Co-IP
        3.2.3 细胞内PPARγ泛素化检测
    3.3 实验结果
        3.3.1 MDM2与PPARγ在细胞内的相互关系
        3.3.2 PPARγ- Y74A突变体抑制了MDM2和PPARγ的绑定关系
        3.3.3 PPARγ-Y74A抑制了EGFR/MDM2信号介导的泛素化过程
        3.3.4 PPARγ-Y74A抑制了EGFR/MDM2信号介导的PPARγ的降解
    3.4 本章小结
第四章 PPARγ-Y74A突变体抑制EGFR/NFκB信号激活
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验细胞系
        4.1.2 实验试剂
        4.1.3 实验仪器与设备
    4.2 实验方法
        4.2.1 mRNA的提取
        4.2.2 反转录PCR
        4.2.3 荧光定量PCR
    4.3 实验结果
        4.3.1 PPARγ与EGFR/NFκB信号的关系
        4.3.2 PPARγ-Y74A与EGFR/NFκB信号的关系
        4.3.3 PPARγ-Y74A与EGFR/NFκB介导基因表达
    4.4 本章小结
第五章 PPARγ-Y74A突变体抑制肿瘤细胞增生、增强化疗药物敏感性
    5.1 实验材料
        5.1.1 实验细胞
        5.1.2 实验试剂
        5.1.3 实验仪器
    5.2 实验方法
        5.2.1 稳定表达细胞系的构建
        5.2.2 细胞计数
        5.2.3 软琼脂克隆集落形成实验soft agar colony formation assay
        5.2.4 MTT实验
        5.2.5 Annexin V/PI双染色法测细胞凋亡
        5.2.6 免疫组化
    5.3 实验结果
        5.3.1 PPARγ-Y74A抑制了c-Myc等抗凋亡蛋白基因表达
        5.3.2 PPARγ-Y74A抑制了肿瘤细胞的增殖
        5.3.3 PPARγ-Y74A增加了细胞对化疗药物的敏感性
        5.3.4 PPARγ-Y74A增加化疗药物诱导的细胞凋亡
        5.3.5 PPARγ和p-PPARγ-Y74在肿瘤组织中的表达
    5.4 本章小结
第六章 总结
参考文献
致谢
在学期间的学术成果
参加课题


【参考文献】：
期刊论文
[1]Suppression of pancreatic carcinoma growth by activating peroxisome proliferator-activated receptor γ involves angiogenesis inhibition[J]. Yu-Wei Dong,Kai Wu,Department of Gastroenterology,Shanghai First People’s Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200080,China Xing-Peng Wang,Department of Gastroenterology,The Tenth People’s Hospital of Tongji University,Yanchang Road(M) ,Shanghai 200072,China.  World Journal of Gastroenterology. 2009(04)



本文编号：3287790