重组人可溶性Tim-3原核表达载体的构建及其重组蛋白的优化表达

发布时间：2021-08-24 13:52

　　目的构建人可溶性Tim-3（sTim-3）的重组质粒表达载体pET28a-sTim-3-EGFP,在大肠埃希菌中进行诱导表达并对其表达条件进行优化。方法取健康人外周血提取总RNA,RT-PCR扩增Tim-3基因胞外段序列,克隆入已构建的表达载体pET28a-EGFP中,鉴定阳性克隆。重组质粒转化BL21（DE3）,通过调整IPTG浓度、诱导时机、诱导温度与诱导时间优化蛋白表达条件。结果成功构建原核表达载体pET28a-sTim-3-EGFP,并转化BL21（DE3）进行诱导表达。温度和IPTG浓度对蛋白表达量影响不大;在培养至A600nm值约为0.6⁰.8时于25℃诱导5h可获得较高的蛋白表达。结论成功表达可溶性重组蛋白sTim-3-EGFP,为该蛋白的进一步纯化生产及应用奠定了良好基础。 

【文章来源】：华中科技大学学报(医学版). 2017,46(03)北大核心CSCD

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【部分图文】：

图４荧光显微镜观察ｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰ融合蛋白的表达（×４００）Ｆｉｇ．４ＭｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘ－

ＩＰＴＧ诱导为最佳。２．３．３ｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰ重组蛋白的诱导时间及温度最佳化经预实验，我们发现ＩＰＴＧ诱导６ｈ以上，蛋白表达无变化。为了找出ＩＰＴＧ诱导表达的最佳温度与诱导时间，我们分别进行不同时间及温度的诱导表达（图７），可见２５℃诱导５ｈ蛋白达到最大表达量，随时间增加表达量不再增加，不同温度诱导表达时表达量区别不大。为了减少ｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰ重组蛋白的降解，确定ＩＰＴＧ诱导表达的最佳温度与诱导时间为２５℃诱导５ｈ。图４荧光显微镜观察ｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰ融合蛋白的表达（×４００）Ｆｉｇ．４ＭｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎ（×４００）Ａ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳及考马斯亮蓝染色；①：蛋白Ｍａｒｋｅｒ；②～⑨：ｐＥＴ２８ａ－ｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰ重组质粒组诱导前及０．０５、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．０、５．０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ浓度下２８℃诱导表达６ｈ；⑩：ｐＥＴ２８ａ空质粒对照组。Ｂ：采用Ｈｉｓ标签单抗及ＥＧＦＰ单抗对重组蛋白进行的验证图５不同ＩＰＴＧ浓度诱导下蛋白的表达及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证Ｆｉｇ．５ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰｐｒｏｔｅｉｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎ－ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＩＰＴＧａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ①：蛋白Ｍａｒｋｅｒ；②：ｐＥＴ２８ａ－ｓＴｉｍ－３－ＥＧＦＰ


本文编号：3360110