雷帕霉素靶蛋白复合物1对Hela细胞微管蛋白稳定性的影响

发布时间：2023-09-16 10:31

　　目的:探讨雷帕霉素靶蛋白复合物1 (mammalian target of rapamycin complex 1,m TORC1)对Hela细胞微管稳定性的影响及可能机制。方法:使用50 nmol/L雷帕霉素预处理Hela细胞24 h后,加入5μmol的诺考达唑处理30、60和120 min,免疫荧光检测微管蛋白的稳定性;使用50 nmol/L雷帕霉素处理Hela细胞24 h后,蛋白质印迹检测促微管解聚蛋白stathmin、KIF2A,促微管聚合蛋白CLIP170,微管切割蛋白Katanin、Spastin的表达变化。转染ATG5-shRNA抑制自噬相关基因5(autophagy-related gene5,ATG5)后,免疫荧光检测微管蛋白稳定性的改变。使用50 nmol/L雷帕霉素预处理Hela细胞24 h后,蛋白质印迹检测Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family member A,Rho A)的表达;转染GFP Rho A-Q63L或GFP Rho A-N19、p190RhoGAP-siRNA质粒后,免疫荧光检测微管稳定性的改变。结果:用雷帕霉素...

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【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 材料
    1.2 细胞培养
    1.3 免疫荧光检测雷帕霉素处理后Hela细胞的微管稳定性
    1.4 蛋白质印迹检测雷帕霉素处理后Hela细胞微管稳定性相关蛋白的表达
    1.5 免疫荧光检测ATG5敲减后Hela细胞的微管稳定性
        1.5.1 质粒构建
        1.5.2 蛋白质印迹验证ATG5的干扰效率
        1.5.3免疫荧光检测微管稳定性
    1.6 免疫荧光检测RhoA在m TORC1调节微管稳定性中的作用
        1.6.1 蛋白质印迹检测雷帕霉素处理后Hela细胞RhoA的表达
        1.6.2 RhoA活化实验
        1.6.3 RhoA抑制实验
    1.7 免疫荧光检测p190RhoGAP在m TORC1调节微管稳定性中的作用
2 结果
    2.1 雷帕霉素作用后Hela细胞微管的稳定性
    2.2 霉帕霉素作用后Hela细胞微管稳定性相关蛋白的表达
    2.3 ATG5基因敲低后Hela细胞的微管稳定性
    2.4 Rho A活性在m TORC1调节微管稳定性中的作用
    2.5 p190RhoGAP在m TORC1调节微管稳定性中的作用
3 讨论



本文编号：3846853