敲除PLAC8蛋白对人胚肾细胞增殖的影响

发布时间：2024-04-07 01:18

　　为了构建PLAC8蛋白敲除的人胚肾细胞株(293T)并检测其对293T细胞增殖的影响,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术及流式细胞分选术构建敲除PLAC8蛋白的293T细胞株,通过基因组测序及错配酶酶切进行编辑细胞系的筛选。用筛选得到的细胞系提取细胞总蛋白,通过蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测编辑效率。进一步通过细胞生存实验(MTT实验)检测敲除PLAC8对293T细胞增殖的影响,通过蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测敲除PLAC8蛋白后293T细胞中增殖相关基因的表达水平变化。结果表明,成功构建了PLAC8蛋白敲除的细胞系。与野生型细胞系相比,PLAC8表达下调会抑制细胞增殖,且在这一过程中AKT、RAF-1、ERK2、C-MYC等4个与增殖相关基因的蛋白水平改变,提示PLAC8可能通过AKT及RAF-1-ERK2-C-MYC这一级联通路信号调控细胞增殖。

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【部分图文】：

图1PLAC8基因结构特征及sgRNA设计

为确定细胞是否被编辑,需要对基因组进行测序检测。因此我们使用软件PrimerPremier5分别在两个sgRNA潜在靶点的上下游200～300bp处各设计了一对检测引物(PLAC8-AF/AR,PLAC8-DF/DR),见图1。引物序列见表2。1.3PX458-sgRN....

图2敲除PLAC8基因的293T细胞株的构建

接下来,我们用lipo3000转染试剂将构建好的两个打靶载体分别转染到293T细胞中,48h后汞灯观察细胞内的绿色荧光,判断转染效率(图2)。由图2可知,PX458-sgRNA-S1和PX458-sgRNA-S2这两个质粒都成功转染到293T细胞中,转染效率约为80%。2.2....

图3PLAC8敲除细胞株的验证

为了进一步检测KD1、KD2细胞株基因组编辑的效率,对KD1、KD2细胞株的总蛋白进行了WesternBlot实验,用野生型293T细胞做阴性对照。结果显示KD1、KD2细胞株中的PLAC8蛋白已经被完全敲除(图3-d)。2.3PLAC8蛋白表达下调对293T细胞增殖的影....

图4PLAC8表达下调对293T细胞增殖的影响

将KD1、KD2细胞系与野生型293T细胞系,分别取对数期细胞以2000/孔的细胞密度接种到96孔板中,用5mg/mL的MTT检测细胞的生长速度并分析数据。结果显示KD1、KD2细胞系的生长速度均明显慢于WT细胞系,具有统计学意义(图4-a)。为了进一步分析PLAC8敲除....

本文编号：3947450