家蝇三龄幼虫Clip-Msp基因克隆及白假丝酵母菌刺激下的时空表达

发布时间：2024-04-20 03:19

　　目的:克隆家蝇的Clip-丝氨酸蛋白酶基因(Clip-Msp),并对Clip-Msp在白假丝酵母菌感染后的时空表达模式进行研究。方法:通过基因工程的方法,构建pMD19-T/Clip-Msp克隆载体;采用生物信息学方法,分析Clip-Msp基因的开放阅读框和氨基酸序列及Clip-Msp蛋白的功能结构域;以GAPDH作为内参照,于家蝇三龄幼虫感染白假丝酵母菌后3、12、24及48 h时,采用实时荧光定量PCR方法检测Clip-Msp在不同组织(体壁、脂肪体、血淋巴、唾液腺、肠道、马氏管和气管)中的表达情况。结果:成功构建pMD19-T/Clip-Msp克隆载体,生物信息学分析显示,Clip-Msp基因开放阅读框全长1 524 bp,共编码507个氨基酸、无信号肽、存在跨膜区,属于非经典分泌型蛋白;Clip-Msp蛋白的N端存在一个Clip结构域,C端有一个Tryp_SPc催化结构域,属于单催化结构域Clip-丝氨酸蛋白酶超家族;白假丝酵母菌感染家蝇三龄幼虫后,Clip-Msp基因在不同时间点、不同组织中表达存在差异(P<005),3 h时以血淋巴中表达量增加最高...

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图1总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果

家蝇三龄幼虫总RNA电泳检测可见：18S条带较28S条带明亮清晰，28S条带暗淡模糊，说明提取的总RNA完整（图1）。用Clip-Msp基因的克隆引物（SkF和SkR）对pMD19-T/Clip-Msp重组菌进行PCR扩增，电泳结果显示，其PCR产物在1524bp左右有一特异....