化脓性链球菌溶血素O基因功能初步研究
发布时间：2022-04-27 19:49
化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）是一类严格以人作为宿主的链球菌,广泛存在于人的粪便和鼻咽部位,可引起从普通非侵袭性疾病如咽炎、猩红热、脓疱病到侵袭性和严重侵袭性疾病如风湿热等疾病的常见人类专性致病菌。链球菌溶血素O（Streptolysin O; SLO）是链球菌产生的重要毒素之一。它不仅可以引起溶血,同时也可强烈引起真核细胞膜损伤,影响细胞膜的物质转运过程,使靶细胞释放胞内成分并致溶解,SLO在链球菌感染过程中起着重要作用。生物信息分析化脓性链球菌溶血素O蛋白结构表明,SLO蛋白除含有由461氨基酸残基组成的溶血活性结构域Thiolcytolysin外,在N端还有一跨膜结构域。本研究利用pET101-GENE蛋白表达系统,成功构建出高表达具有SLO活性的重组蛋白重组子,采用镍柱亲和层析分离技术,纯化目的蛋白；纯化蛋白SDS-PAGE检测分析表明,重组蛋白与预测的溶血活性结构域的分子量相一致；溶血实验显示,纯化重组蛋白具有溶血活性。以纯化的重组蛋白为免疫原,对大鼠进行4次免疫,所获得免疫血清经Elisa检测,抗SLO血清效价达到1：12...
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 GAS引起感染相关的毒力因子
1.1.1 M蛋白
1.1.2 链球菌致热外毒素B
1.1.3 GAPDH
1.1.4 NADase
1.1.5 CovRS双组份系统
1.2 化脓性链球菌溶血素O
1.2.1 SLO基因与表达
1.2.2 SLO的蛋白结构
1.2.3 溶血素介导的转位作用(Cytolysin-mediated translocation,CMT)
1.3 研究内容和意义
1.4 技术路线
第2章 SLO重组蛋白及其多克隆抗体的制备
2.1 实验材料
2.1.1 试剂与仪器
2.1.2 培养基与溶液
2.2 实验方法
2.2.1 重组SLO表达载体的构建
2.2.1.1 目的基因的PCR
2.2.1.2 重组质粒的连接与转化
2.2.2 重组SLO的诱导表达
2.2.3 重组蛋白的纯化
2.2.4 动物免疫与多克隆抗体血清制备
2.2.5 抗体效价分析
2.2.6 Western Blot分析多克隆抗体
2.3 结果与讨论
2.3.1 SLO表达载体的构建与表达
2.3.2 SLO重组蛋白纯化与溶血活性分析
2.3.3 抗体的制备和Elisa评价多克隆抗体效价
2.3.4 多克隆抗体的Western Blot鉴定
2.4 本章小结
第3章 化脓性链球菌溶血素O基因突变株的构建
3.1 实验材料
3.1.1 菌种、质粒和蛋白
3.1.2 实验试剂与仪器
3.1.3 培养基与溶液
3.2 实验方法
3.2.1 DNA的提取与目标基因的PCR
3.2.2 重组质粒的构建
3.2.3 化脓性链球菌突变株的构建
3.2.4 突变株的验证
3.3 结果与讨论
3.3.1 重组敲出质粒的鉴定
3.3.2 突变株的染色体slo基因PCR鉴定
3.3.3 突变株的SLO蛋白缺失验证
3.4 本章小结
第4章 SLO基因突变对GAS毒力的影响
4.1 实验材料
4.1.1 实验菌株菌种
4.1.2 实验试剂与仪器
4.1.3 培养基与试剂
4.2 实验方法
4.2.1 slo基因突变对GAS生长的影响
4.2.2 NADase的活性测定
4.2.3 GAPDH活性测定
4.2.4 slo基因突变对链球菌致热外毒素B的影响
4.2.5 slo基因突变对GAS毒力的影响
4.3 结果与讨论
4.3.1 slo基因突变对GAS生长的影响
4.3.2 slo基因突变对NADase活性影响
4.3.3 slo基因突变对细胞表面GAPDH活性影响
4.3.4 slo基因突变对对SpeB的影响
4.3.5 slo基因突变对GAS对细胞的粘附的影响
4.3.6 slo基因突变对化脓性链球菌改变宿主细胞通透性能力的影响
4.5 本章小结
结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]链球菌烯醇化酶与致热外毒素B成熟的相关性[J]. 胡珊,马超,李学如,黎明,刘彦宏,江南屏,郭泰林,姚宁. 高等学校化学学报. 2013(04)
[2]链球菌致热外毒素SpeB致病性研究进展[J]. 张波,李学如,江南屏,任瑶瑶. 中国感染控制杂志. 2012(04)
[3]关注国内儿科A族链球菌的分型和耐药状况[J]. 姚开虎. 中国实用儿科杂志. 2012(04)
[4]A群链球菌利用人纤溶酶原的机制[J]. 许丽萍,李培峰,韩润林. 生命的化学. 2010(03)
[5]酪素平板法检测临床分离A族链球菌致热外毒素B活性研究[J]. 李学如,李尧,王艳,姚宁,郭泰林,孟涛. 中华检验医学杂志. 2009 (06)
硕士论文
[1]化脓性链球菌htrA与蛋白分泌相关性初步研究[D]. 胡珊.西南交通大学 2013
[2]肠出血性大肠杆菌O157:H7 TccP蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备和应用研究[D]. 杨琴.重庆医科大学 2007
本文编号：3649067
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 GAS引起感染相关的毒力因子
1.1.1 M蛋白
1.1.2 链球菌致热外毒素B
1.1.3 GAPDH
1.1.4 NADase
1.1.5 CovRS双组份系统
1.2 化脓性链球菌溶血素O
1.2.1 SLO基因与表达
1.2.2 SLO的蛋白结构
1.2.3 溶血素介导的转位作用(Cytolysin-mediated translocation,CMT)
1.3 研究内容和意义
1.4 技术路线
第2章 SLO重组蛋白及其多克隆抗体的制备
2.1 实验材料
2.1.1 试剂与仪器
2.1.2 培养基与溶液
2.2 实验方法
2.2.1 重组SLO表达载体的构建
2.2.1.1 目的基因的PCR
2.2.1.2 重组质粒的连接与转化
2.2.2 重组SLO的诱导表达
2.2.3 重组蛋白的纯化
2.2.4 动物免疫与多克隆抗体血清制备
2.2.5 抗体效价分析
2.2.6 Western Blot分析多克隆抗体
2.3 结果与讨论
2.3.1 SLO表达载体的构建与表达
2.3.2 SLO重组蛋白纯化与溶血活性分析
2.3.3 抗体的制备和Elisa评价多克隆抗体效价
2.3.4 多克隆抗体的Western Blot鉴定
2.4 本章小结
第3章 化脓性链球菌溶血素O基因突变株的构建
3.1 实验材料
3.1.1 菌种、质粒和蛋白
3.1.2 实验试剂与仪器
3.1.3 培养基与溶液
3.2 实验方法
3.2.1 DNA的提取与目标基因的PCR
3.2.2 重组质粒的构建
3.2.3 化脓性链球菌突变株的构建
3.2.4 突变株的验证
3.3 结果与讨论
3.3.1 重组敲出质粒的鉴定
3.3.2 突变株的染色体slo基因PCR鉴定
3.3.3 突变株的SLO蛋白缺失验证
3.4 本章小结
第4章 SLO基因突变对GAS毒力的影响
4.1 实验材料
4.1.1 实验菌株菌种
4.1.2 实验试剂与仪器
4.1.3 培养基与试剂
4.2 实验方法
4.2.1 slo基因突变对GAS生长的影响
4.2.2 NADase的活性测定
4.2.3 GAPDH活性测定
4.2.4 slo基因突变对链球菌致热外毒素B的影响
4.2.5 slo基因突变对GAS毒力的影响
4.3 结果与讨论
4.3.1 slo基因突变对GAS生长的影响
4.3.2 slo基因突变对NADase活性影响
4.3.3 slo基因突变对细胞表面GAPDH活性影响
4.3.4 slo基因突变对对SpeB的影响
4.3.5 slo基因突变对GAS对细胞的粘附的影响
4.3.6 slo基因突变对化脓性链球菌改变宿主细胞通透性能力的影响
4.5 本章小结
结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]链球菌烯醇化酶与致热外毒素B成熟的相关性[J]. 胡珊,马超,李学如,黎明,刘彦宏,江南屏,郭泰林,姚宁. 高等学校化学学报. 2013(04)
[2]链球菌致热外毒素SpeB致病性研究进展[J]. 张波,李学如,江南屏,任瑶瑶. 中国感染控制杂志. 2012(04)
[3]关注国内儿科A族链球菌的分型和耐药状况[J]. 姚开虎. 中国实用儿科杂志. 2012(04)
[4]A群链球菌利用人纤溶酶原的机制[J]. 许丽萍,李培峰,韩润林. 生命的化学. 2010(03)
[5]酪素平板法检测临床分离A族链球菌致热外毒素B活性研究[J]. 李学如,李尧,王艳,姚宁,郭泰林,孟涛. 中华检验医学杂志. 2009 (06)
硕士论文
[1]化脓性链球菌htrA与蛋白分泌相关性初步研究[D]. 胡珊.西南交通大学 2013
[2]肠出血性大肠杆菌O157:H7 TccP蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备和应用研究[D]. 杨琴.重庆医科大学 2007
本文编号：3649067
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