呼吸道合胞病毒重组蛋白D9-G126-F/M2的表达及检测

发布时间：2023-05-13 04:37

　　呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)感染流行地域广、时间长,遍布全球,在气候温和地区于寒冷的冬春发生,在热带地区雨季发生,是引起婴幼儿细支气管炎和肺炎的重要病原[1,2],在老年人及免疫功能低下的人群中也容易形成严重的呼吸道感染。但由于多种限制因素包括RSV A、B两亚型交错出现,合适的载体蛋白选择困难等的制约,目前还没有成功、安全的疫苗问世[6]。RSV所致疾病严重而频繁地出现于6个月以下的儿童中,因此WHO已将其列为优先发展的疫苗。 本研究的主要目的是在寻求可能用于RSV疫苗研制的重组蛋白抗原的目标下,检测我们设计构建载体并表达出的DsbA-G126-F/M2:81-95蛋白的免疫活性,为进一步研究出高效、安全的疫苗打下基础。在对G蛋白全长基因克隆及表达载体的筛选等工作的基础上,我们将G蛋白基因100～225的一段与F/M2:81～95片段共同连接进pET-15b(DsbA)表达载体中,于E.coli BL21(DE3)中表达出目的蛋白,经检测目的蛋白是以包涵体形式表达,对目的蛋白进行分离纯化后采用腹腔注射的方法免疫9周龄的雌性BALB/...

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
文献综述
    第一章 呼吸道合胞病毒的研究进展
        1 吸道合胞病毒研究概况
            1.1 呼吸道合胞病毒的起源分类
            1.2 生物学特征
                1.2.1 病毒形态
                1.2.2 侵入释放
                1.2.3 病毒培养
                1.2.4 抵抗力
            1.3 分子生物学研究
                1.3.1 F 蛋白
                1.3.2 SH 蛋白
                1.3.3 P 蛋白
            1.4 G 蛋白研究进展
                1.4.1 结构特点
                1.4.2 抗原结构
                1.4.3 G 蛋白的进化类型
                1.4.4 G 蛋白的免疫作用和致病机制
            1.5 流行病学
            1.6 临床症状
            1.7 诊断方法
            1.8 影响 RSV 感染严重程度的因素
                1.8.1 宿主因素
                1.8.2 病毒因素
                1.8.3 地域差异
                1.8.4 其他因素
            1.9 实验动物模型
            1.10 RSV 治疗药物进展
                1.10.1 人工合成的抗病毒化合物
                1.10.2 天然药物中获得的抗病毒药
            1.11 免疫病理学
            1.12 疫苗研究进展
                1.12.1 保护性抗原
                1.12.2 福尔马林灭活 RSV 疫苗
                1.12.3 活病毒疫苗
                1.12.4 遗传工程疫苗
                1.12.5 载体疫苗
                1.12.6 亚单位疫苗
                1.12.7 质粒 DNA 疫苗
                1.12.8 合成肽类疫苗
                1.12.9 佐剂
试验研究
    第二章 pET-DsbA-G126-F/M2:81-95 表达载体的构建
        2.1 材料
            2.1.1 病毒、菌种和载体
            2.1.2 试剂
        2.2 方法
            2.2.1 质粒的提取
            2.2.2 G126 的扩增
            2.2.3 CTL 的扩增
            2.2.4 G126,CTL 片段的处理
            2.2.5 载体双酶切鉴定
            2.2.6 连接反应
            2.2.7 转化
            2.2.8 PCR 鉴定
        2.3 结果
            2.3.1 pET-DsbA-G126-F/M2:81－95 表达载体的构建
            2.3.2 PCR 扩增 G126 片段及 F/M2 片段的结果
            2.3.3 酶切载体及 F/M2 片段的结果
            2.3.4 连接转化后筛选阳性克隆
            2.3.5 PCR 鉴定
        2.4 讨论
    第三章 重组蛋白 D9-G126-F/M2 的表达、纯化及功能检测
        3.1 材料
            3.1.1 病毒、菌种和质粒
            3.1.2 试剂
            3.1.3 实验动物
        3.2 方法
            3.2.1 预表达
            3.2.2 Western blot 检测表达蛋白免疫活性
            3.2.3 融合蛋白的可溶性测试
            3.2.4 融合蛋白的表达
            3.2.5 融合蛋白的纯化
            3.2.6 细胞和病毒的培养
            3.2.7 免疫动物以及抗体的制备
            3.2.8 中和抗体滴度的检测
            3.2.9 ELISA 检测抗体滴度
            3.2.10 CTL 检测
        3.3 结果
            3.3.1 预表达
            3.3.2 Western blot 检测表达蛋白免疫活性
            3.3.3 融合蛋白的可溶性测试
            3.3.4 融合蛋白的纯化
            3.3.5 中和抗体滴度的检测
            3.3.6 ELISA 检测抗体滴度
            3.3.7 CTL 应答
        3.4 讨论
        3.5 小结
结论
参考文献
英文缩略词
致谢
作者简介



本文编号：3815316