α型人肿瘤坏死因子在鱼腥藻7120中的表达及其初步纯化

发布时间：2024-01-24 18:56

　　人肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种由体内激活的单核巨噬细胞产生的细胞因子。体内外试验表明其对多种肿瘤细胞株有显著的杀伤作用，尤其是局部应用TNF-α进行抗肿瘤治疗的效果明确。TNF-α是一由157个氨基酸组成的非糖基化多肽蛋白，分子量为17350Da；其生物活性形式为三聚体。目前重组TNF-α主要在大肠杆菌中克隆和表达。但是大肠杆菌的生长需要较多贵重的生化制剂；此外大肠杆菌自身含有毒蛋白，从而使大肠杆菌表达的TNF-α纯化工艺复杂化。蓝藻是一类光合自养原核生物，可作为各类生化过程研究的理想模式。由于蓝藻的生长只需阳光、二氧化碳和少数无机盐，其自身一般不含毒蛋白；加上蓝藻的大规模培养具有经济和洁净等特点，因此可将蓝藻作为大肠杆菌重组DNA产品生产的替代宿主。为探讨利用重组蓝藻进行抗肿瘤细胞因子生产的可能性，我们将人TNF-α基因转入单细胞丝状鱼腥藻7120中表达，并对表达产物进行初步的纯化。 质粒PT-TNF经EcoR I和Xho I双酶切后，分离回收含人TNF-α衍生物cDNA(0.7kb)片段。片段的Xho I酶切端经Klenow聚合酶补平后，插入质粒PRL439的psbA...

【文章页数】：67 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 概论
    1.1 人肿瘤坏死因子的分子生物学进展
        1.1.1 人TNF分子理化特点
        1.1.2 人TNF基因及其表达产物的特征
        1.1.3 TNF受体的特性
        1.1.4 TNF的生物学效应
        1.1.5 TNF的抗肿瘤机制
        1.1.6 TNF临床抗肿瘤应用展望
    1.2 蓝藻基因工程进展
        1.2.1 蓝藻的基因转移
        1.2.2 外源基因在蓝藻细胞中的稳定存在
        1.2.3 表达载体
        1.2.4 外源基因在蓝藻中的表达
    1.3 国内外藻类基因工程制药技术发展概况
    1.4 本课题研究的意义及主要研究内容
        1.4.1 本课题研究的意义
        1.4.2 研究的主要内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 主要仪器设备
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 菌株和质粒
        2.1.4 蓝藻藻种和细胞株
        2.1.5 常用试剂配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 细菌质粒DNA的快速提取和纯化
            2.2.1.1 改良SET法快速制备质粒DNA
            2.2.1.2 Quantum Prep小量DNA纯化法
        2.2.2 质粒的限制性内切酶分析和酶切片段的回收
            2.2.2.1 限制性内切酶分析
            2.2.2.2 酶切片段的回收
        2.2.3 DNA片段末端补平
        2.2.4 DNA片段的连接和转化
            2.2.4.1 连接
            2.2.4.2 转化
        2.2.5 鱼腥藻Anabaena sp.PCC7120的培养和保种方式
        2.2.6 三亲结合转移
        2.2.7 蓝藻质粒DNA的提取
        2.2.8 随机引物法制备³²P-DNA探针
        2.2.9 Southern印迹杂交法
            2.2.9.1 Southern转移-把凝胶电泳上的DNA转移到硝酸纤维素膜
            2.2.9.2 Southern膜的杂交
        2.2.10 TNF-α产物的表达及电泳鉴定方法
            2.2.10.1 TNF-α在大肠杆菌TG1中的表达
            2.2.10.2 TNF-α在鱼腥藻7120中的表达
            2.2.10.3 表达产物的电泳鉴定方法
        2.2.11 蛋白质免疫印迹分析(Western Blotting)
            2.2.11.1 电转移
            2.2.11.2 免疫学检测
        2.2.12 转基因鱼腥藻7120的组织形态学检查和生长曲线测定
            2.2.12.1 普通光镜观察
            2.2.12.2 透射电镜观察
            2.2.12.3 生长曲线测定
        2.2.13 rhTNF-α的初步分离纯化和鉴定
            2.2.13.1 分离纯化
            2.2.13.2 鉴定
第三章 结果与讨论
    3.1 穿梭表达载体(PDC-TNF)的构建及鉴定
        3.1.1 中间载体PRL-TNF的构建
        3.1.2 PDC-TNF的构建
        3.1.3 SDS-PAGE和Western Blotting分析
    3.2 TNF-α在鱼腥藻7120中的表达和检测
        3.2.1 PDC-TNF三亲结合导入单细胞丝状鱼腥藻7120细胞
        3.2.2 转基因鱼腥藻7120质粒提取和Southern杂交分析
        3.2.3 SDS-PAGE和Western Blotting分析TNF-α基因在鱼腥藻7120中的表达
    3.3 转PDC-TNF鱼腥藻7120的组织学检查和生长曲线测定
        3.3.1 组织学检查
        3.3.2 生长曲线的测定
    3.4 转TNF基因鱼腥藻7120的稳定性
    3.5 rhTNF-α的初步分离纯化和生物学活性检测
        3.5.1 TNF粗提液制备结果
        3.5.2 阴离子交换柱层析纯化结果
第四章 结论与展望
参考文献
致谢
在读期间发表的论文
在读期间参加的重要学术会
在读期间获得的科研成果



本文编号：3884287