抗肺癌单链抗体偶联绿色荧光蛋白基因的构建及表达研究

发布时间：2024-02-15 12:08

　　绿色荧光蛋白作为一种新型的标记分子，可应用于活体细胞的实时检测。目前已有相当多的文献报道关于将GFP基因与特定抗体或细胞因子基因结合进行融合表达的研究，证明融合蛋白具有GFP的荧光性质和配体蛋白质的生物功能，可用于对肿瘤的检测、药物筛选、细胞因子受体的分布以及功能等方面的研究，应用前景广阔。 目前国内关于将绿色荧光蛋白与其他细胞因子融合表达的报道较少。相关的报道有抗肝癌单链抗体融合GFP在真核细胞中的表达，以及重组IL-18-GFP融合蛋白活性研究等。本论文拟将抗肺癌单链抗体连接绿色荧光蛋白进行融合表达，预期目标蛋白应同时具有抗体活性及光激发绿色荧光双重功能。 本实验经PCR方法从mRNA逆转录产物中克隆到抗肺癌抗体的重链可变区和轻链可变区，并利用重叠延伸PCR方法将其构建为单链抗体scfv形式。利用酶切连接将scfv基因序列插入到绿色荧光蛋白基因3’-端构成gfp-scfv重组基因，并转化大肠杆菌表达。经IPTG诱导表达后并SDS-PAGE蛋白电泳，与阴性菌对照，在预期分子量范围内出现一明显条带。利用Ni-NTA树脂纯化蛋白，出现两个明显的峰。SDS-PAGE电泳分析...

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一部分 绿色荧光蛋白研究进展
    前言
    1 、 绿色荧光蛋白的理化性质
    2 、 绿色荧光蛋白的化学结构和发光机制
        2.1 绿色荧光蛋白的化学结构
        2.2 野生型绿色荧光蛋白的发光机制
        2.3 突变型GFP的发光机制
            2.3.1 Ⅰ型突变
            2.3.2 Ⅱ型突变
            2.3.3 Ⅲ型突变
    3 、 绿色荧光蛋白在生物技术中的应用
        3.1 分子标记
            3.1.1 基因表达的报告
            3.1.2 在细胞生物学中作为荧光标记用于细胞动态的研究
            3.1.3 活细胞内蛋白的定位研究
        3.2 GFP在信号转导中的应用
        3.3 药物筛选
        3.4 融合抗体
        3.5 生物传感器
    4 、 展望
    参考文献
第二部分 抗肺癌单链抗体偶联绿色荧光蛋白基因的构建及表达研究
    前言
    1 、 实验材料和仪器
        1.1 菌种及质粒
        1.2 酶
        1.3 各种试剂盒
        1.4 缓冲液及其他溶液
        1.5 培养液和固体培养基
        1.6 其它主要试剂和商品来源
        1.7 电泳胶
        1.8 PCR引物
        1.9 主要仪器
    2 、 方法
    3 、 结果
        3.1 抗体重链和轻链可变区的克隆
        3.2 重链和轻链的序列测定
        3.3 VL基因的修饰
        3.4 单链抗体的构建
        3.5 Pro319质粒的构建
        3.6 gfp-scfv基因构建
        3.7 gfp-scfv基因在大肠杆菌的表达
    4 、 讨论
    参考文献
附录1 Pava319质粒序列
附录2 英文缩写词表
致谢



本文编号：3899722