大肠杆菌来源核酶P M1亚单位对人巨细胞病毒磷酸转移酶基因mRNA片段的体外切割研究

发布时间：2024-03-06 01:43

　　背景：大肠杆菌来源RNase P为一催化tRNA前体5′端成熟的核糖蛋白复合体，催化核心M1 RNA由377个核苷酸组成，可在一定盐离子环境下体外单独对RNA底物进行特异切割。RNase P为结构识别酶，其底物至少包括两个要件：1 游离NCCA-3′末端；2 特异互补的双链RNA区域。与底物特异互补的RNA片段称为GS，将GS与M1 RNA共价连接为M1GS，是具备自我引导和序列特异切割能力的核酶。 目的：筛选出靶定人巨细胞病毒(HCMV)磷酸转移酶基因的高特异性、高活性的M1GS核酶，为进一步研究以RNase P为基础的反义RNA技术抑制病毒基因表达奠定理论基础。 方法：从HCMV磷酸转移酶基因UL97序列中搜索出8个适合GS互补的靶位，克隆构建得8个M1GS核酶；将UL97基因中靶位集中的后1／4部分克隆至pGEM3z质粒。对M1GS DNA模板和两个底物模板分别进行体外转录，获得核酶M1GS及带有³²P放射性标记的两个底物片段的RNA。将M1GS与相对应的底物片段RNA在体外切割缓冲液中混合反应后电泳分离，自显影检测。 结果：从自显影...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图4MIRNA三级结构

成+378/+379RNA;途径11却直接就形成+378/+379RNAMlRNA还多一个或两个核营酸的剪切产物)。随后其MlRNA。(图2)【’〕_产竺里科3B5/+38。，间体一、，人厂一3了日l+3了gR润A一-一今成熟朋1RN人途径n图2成熟MlRNA形成过程征:二级结构....

图12Pu97重组质粒鉴定电泳2EeoRI+Sall双酶切PU97;3酶切PU97;5PU97重组质粒;6Sall酶切PU97;Marker

巨细胞病毒磷酸转移酶基因mRNA片段的体于体外转录。T7和SP6双启动子双酶切验证，结果显示PCR获得linel)，此带与PU97质粒双酶PU97质粒单酶切后，产生了大(图12line31ine4)。电泳结组子PU97进行了基因的全长测序

图14突变Marker;2MIGS重组质粒;MIGS克隆质粒的鉴定电泳3KPnl+Hindlll双酶切重组子;4酶切重组质粒;5Kpnl单酶切重组质粒;6AD(MIGsT3)片段pCRHind111单产物;7CD

0004000300020001600100020001600100051739623075(50(图14突变Marker;2MIGS重组质粒;MIGS克隆质粒的鉴定电泳3KPnl+Hindlll双酶切重组子;4酶切重组质粒;5Kpnl单酶切重组质粒;6AD(MIGsT3)片段p....

图1，Fu，/一u乙里组从私金正电泳Marker:2EeoRI+Sall双酶切PU97一DZ重组质粒;3Sall酶切PU97一DZ重组质粒;4EeoRI酶切PU97;5PU97一DZ重组质粒;6PU97一DZPCR产物;7Marker

图18uL97DZ片段亚克隆技质粒的鉴定和双酶切验证，结果显示PCR19line6)，此带与PU97一DZeZ)，PU97一DZ质粒单酶切后，大小相符(图19line31in1234567

本文编号：3920360