实时荧光环介导等温扩增技术检测土壤中的类鼻疽伯克霍尔德菌

发布时间：2024-03-22 03:40

　　目的结合荧光染料EvaGreen与环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)探索快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的可行性。方法根据类鼻疽伯克霍尔德菌filc基因片段设计了LAMP引物,利用荧光染料EvaGreen建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RealAmp),优化反应条件,扩增产物经电泳鉴定。通过类鼻疽伯克霍尔德菌和其他致病菌验证特异性,比较RealAmp与普通LAMP技术的敏感度,并测定人工污染土壤模拟样本的检出限。结果恒温63℃条件下,20～60 min即可完成RealAmp检测;利用该方法检测类鼻疽伯克霍尔德菌为阳性,其余致病菌如鼠疫杆菌、布鲁氏杆菌、大肠杆菌等13株参考菌株及蜱虫的DNA(含大量假单胞菌属细菌)呈扩增阴性;RealAmp技术检测类鼻疽伯克霍尔德菌核酸的灵敏度为10² CFU/mL,检测克隆株质粒的灵敏度可达10¹ copies/μL,比...

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【部分图文】：

图１ＲｅａｌＡｍｐ检测类鼻疽伯克霍尔德菌Ｆｉ．１ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉｂＲｅａｌ－１：阳性对照２：阴性对照

２．１ＲｅａｌＡｍｐ检测类鼻疽伯克霍尔德菌方法的建立如图１所示，当反应进行至２５个循环（１ｍｉｎ／循环）时，阳性对照管的荧光强度大幅度增加，荧光曲线斜率增加，当反应进行至４０个循环，荧光信号增加强度逐渐变缓，直至反应结束，仪器判定为阳性结果，说明发生了扩增反应。阴性对照管荧光曲线....

图２电泳验证ＲｅａｌＡｍｐ扩增产物Ｍ：１００ｂｐｍａｒｋｅｒ；１：阳性对照；２：阴性对照

曲线斜率增加，当反应进行至４０个循环，荧光信号增加强度逐渐变缓，直至反应结束，仪器判定为阳性结果，说明发生了扩增反应。阴性对照管荧光曲线一直处于平滑的状态，直到反应终止也没有曲线斜率的变化，仪器判定为阴性结果，说明没有发生扩增反应。１：阳性对照２：阴性对照图１ＲｅａｌＡｍｐ检测类....

本文编号：3934581