非病毒载体融合蛋白基因的克
发布时间：2024-03-22 18:59
本实验的目的旨在克隆、表达可将外源蛋白或寡核苷酸等基因治疗物质带入细胞质、进而进入细胞核的载体蛋白(Carrier)。在此我们克隆表达了两个载体，先是利用能够穿过细胞质膜的蛋白转导结构域TAT，并在TAT后面连上来自猿猴病毒大T抗原的核定位信号（nuclear localization signal, NLS），然后在TAT-NLS序列的后面接上报告基因增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, eGFP）。最后获得一个含有TAT-NLS-eGFP基因的pET-22b(+)质粒，即pET-TAT-NLS-eGFP，以该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，并诱导表达TAT-NLS-eGFP蛋白。探讨体外克隆、表达、纯化融合蛋白TAT-NLS-eGFP的可行性，并对融合蛋白的功能进行初步鉴定。其次将编码人高迁移组蛋白2（human high mobility group protein 2 , HMGN2, 以前称HMG-17）N-末端一个片段的序列（F3序列）连上报告基因eGFP，同样获得一个含有F3-eGFP基因的pET-22b(+)质粒...
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
英文摘要
材料与方法
1 材料
1.1 TAT-NLS序列、F3序列及引物合成序列与测序
1.1.1 TAT-NLS序列
1.1.2 F3序列
1.1.3 扩增eGFP的引物
1.2 细胞株、菌株、质粒
1.3 分子生物学工具酶
1.4 细胞培养用品
1.5 蛋白质纯化材料
1.6 蛋白质罗丹明标记
1.7 其他常规试剂、无机盐
1.8 常用缓冲液及细菌培养基LB
1.9 实验仪器
2 方法
2.1 各合成片段的连接
2.2 PCR扩增eGFP基因
2.3 质粒载体的构建
2.3.1 含TAT-NLS质粒pET-TAT-NLS的构建
2.3.2 含F3质粒pET-F3的构建
2.3.3 原核表达载体pET-TAT-NLS-eGFP、pET-F3-eGFP和pET-eGFP的构建
2.4 重组融合蛋白及eGFP蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
2.5 目的蛋白在细菌细胞中位置的鉴定
2.6 可溶表达上清的制备
2.7 目的蛋白的纯化
2.8 融合蛋白的浓缩
2.9 罗丹明标记蛋白质
2.10 蛋白质浓度测定
2.11 细胞培养
2.12 细胞转导试验融合蛋白的准备
2.13 融合蛋白对体外培养细胞的转导试验
2.13.1 融合蛋白TAT-NLS-eGFP在体外对细胞的转导
2.13.2 融合蛋白F3-eGFP在体外对细胞的转导
结果
1 非病毒载体融合蛋白基因TAT-NLS-eGFP的克隆、表达与纯化
1.1 融合蛋白基因TAT-NLS-eGFP的克隆
1.1.1 质粒pET-TAT-NLS的构建
1.1.2 PCR扩增绿色荧光蛋白基因eGFP
1.1.3 表达载体pET-TAT-NLS-eGFP的构建
1.1.4 表达载体pET-TAT-NLS-eGFP的测序鉴定
1.2 融合蛋白TAT-NLS-eGFP的诱导表达与纯化
2 非病毒载体融合蛋白基因F3-eGFP的克隆、表达与纯化
2.1 融合蛋白基因F3-eGFP的克隆
2.1.1 质粒pET-F3的构建
2.1.2 表达载体pET-F3-eGFP的构建
2.1.3 表达载体pET-F3-eGFP的测序鉴定
2.1.4 融合蛋白F3-eGFP的诱导表达与纯化
3 非病毒载体融合蛋白对体外培养细胞的转导实验
3.1 融合蛋白TAT-NLS-eGFP的细胞转导实验
3.2 融合蛋白F3-eGFP的细胞转导实验
3.3 罗丹明标记的融合蛋白F3-eGFP的细胞转导实验
讨论
1 非病毒载体融合蛋白基因TAT-NLS-eGFP/F3-eGFP的克隆、表达与纯化
2 融合蛋白TAT-NLS-eGFP和F3-eGFP可以有效地转导体外培养的肿瘤细胞
参考文献
综述
致谢
攻读硕士期间发表的学术论文目录
本文编号：3934824
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材料与方法
1 材料
1.1 TAT-NLS序列、F3序列及引物合成序列与测序
1.1.1 TAT-NLS序列
1.1.2 F3序列
1.1.3 扩增eGFP的引物
1.2 细胞株、菌株、质粒
1.3 分子生物学工具酶
1.4 细胞培养用品
1.5 蛋白质纯化材料
1.6 蛋白质罗丹明标记
1.7 其他常规试剂、无机盐
1.8 常用缓冲液及细菌培养基LB
1.9 实验仪器
2 方法
2.1 各合成片段的连接
2.2 PCR扩增eGFP基因
2.3 质粒载体的构建
2.3.1 含TAT-NLS质粒pET-TAT-NLS的构建
2.3.2 含F3质粒pET-F3的构建
2.3.3 原核表达载体pET-TAT-NLS-eGFP、pET-F3-eGFP和pET-eGFP的构建
2.4 重组融合蛋白及eGFP蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
2.5 目的蛋白在细菌细胞中位置的鉴定
2.6 可溶表达上清的制备
2.7 目的蛋白的纯化
2.8 融合蛋白的浓缩
2.9 罗丹明标记蛋白质
2.10 蛋白质浓度测定
2.11 细胞培养
2.12 细胞转导试验融合蛋白的准备
2.13 融合蛋白对体外培养细胞的转导试验
2.13.1 融合蛋白TAT-NLS-eGFP在体外对细胞的转导
2.13.2 融合蛋白F3-eGFP在体外对细胞的转导
结果
1 非病毒载体融合蛋白基因TAT-NLS-eGFP的克隆、表达与纯化
1.1 融合蛋白基因TAT-NLS-eGFP的克隆
1.1.1 质粒pET-TAT-NLS的构建
1.1.2 PCR扩增绿色荧光蛋白基因eGFP
1.1.3 表达载体pET-TAT-NLS-eGFP的构建
1.1.4 表达载体pET-TAT-NLS-eGFP的测序鉴定
1.2 融合蛋白TAT-NLS-eGFP的诱导表达与纯化
2 非病毒载体融合蛋白基因F3-eGFP的克隆、表达与纯化
2.1 融合蛋白基因F3-eGFP的克隆
2.1.1 质粒pET-F3的构建
2.1.2 表达载体pET-F3-eGFP的构建
2.1.3 表达载体pET-F3-eGFP的测序鉴定
2.1.4 融合蛋白F3-eGFP的诱导表达与纯化
3 非病毒载体融合蛋白对体外培养细胞的转导实验
3.1 融合蛋白TAT-NLS-eGFP的细胞转导实验
3.2 融合蛋白F3-eGFP的细胞转导实验
3.3 罗丹明标记的融合蛋白F3-eGFP的细胞转导实验
讨论
1 非病毒载体融合蛋白基因TAT-NLS-eGFP/F3-eGFP的克隆、表达与纯化
2 融合蛋白TAT-NLS-eGFP和F3-eGFP可以有效地转导体外培养的肿瘤细胞
参考文献
综述
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本文编号：3934824
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