青藏高原不同地区垂穗披碱草青贮饲料中乳酸菌多样性及优势菌种的发酵特性研究

发布时间：2017-03-31 01:29

  本文关键词：青藏高原不同地区垂穗披碱草青贮饲料中乳酸菌多样性及优势菌种的发酵特性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本研究采用真空袋法对青藏高原四个不同地区(天祝、果洛、当雄、那曲)的垂穗披碱草(Elymus nutans)进行青贮,并通过第三代16S全长高通量测序(PacBioⅡ平台)对青藏高原四个地区及不同发酵阶段(14、30、60、90天)垂穗披碱草青贮饲料发酵体系中的微生物(细菌)多样性进行了研究;同时,对不同发酵阶段青贮饲料中的优势乳酸菌进行分离鉴定、产酸能力和耐低温能力的筛选研究;将表现优良的乳酸菌作为青贮饲料乳酸菌添加剂添加到垂穗披碱草中,在10、15、25℃条件下进行青贮发酵,研究其对青贮发酵品质的影响,以期为开发适合青藏高原地区青贮用乳酸菌添加剂提供理论依据,试验结果如下:1.青藏高原四个不同地区垂穗披碱草青贮饲料中的微生物多样性存在明显的差异,并且各地区垂穗披碱草青贮饲料发酵体系中微生物的多样性随青贮时间的演替特征也各不相同。就乳酸菌而言,通过高通量测序得知青藏高原垂穗披碱草青贮饲料中的乳酸菌主要包括6个属,分别为肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、明串珠属(Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weissella)和乳球菌属(Lactococcus);这6个属的乳酸菌鉴定到种水平的有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、肠膜明串珠(Leuconostoc mesenteroides)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)等28个种。2.由于地理、气候条件的差异,青藏高原不同的采样地点采集到的垂穗披碱草附着的乳酸菌也存在明显的差异。天祝地区鲜样中的微生物主要为假单胞菌属(Pseudomonas,45%)和泛菌属(Pantoea,17%),乳酸菌主要为食窦魏斯氏菌(4.21%)和肠膜明串珠菌(1.03%),其他乳酸菌比例较小;果洛的鲜样中以乳杆菌(45.8%)和肠球菌(33.3%)为主;当雄地区的鲜草中主要是食窦魏斯氏菌,占整个细菌丰度的94.46%;那曲地区鲜样中的优势菌以占比60%的肠膜明串珠菌为主。3.同一地区采集的垂穗披碱草在不同发酵阶段其样品中微生物种类不同。就乳酸菌而言,天祝地区样品发酵至60天时杂菌才被乳酸菌取代,分别有52%的戊糖片球菌,21%的乳杆菌和15%的肠膜明串珠菌。发酵90天后肠膜明串珠菌占比31.97%,棒状乳杆菌占比24.32%,戊糖片球菌占19.67%。从果洛地区可明显的看出乳杆菌在整个青贮阶段都发挥着主导作用,尤其是短乳杆菌在14、60、90天分别占比60.19%、71.02%、73.76%。当雄地区草样在发酵开始后魏斯氏菌的优势地位被乳杆菌和明串珠菌代替,在发酵14天时乳杆菌占51.68%,30天时升至60.87%,60天时短乳杆菌高达82.75%,90天时乳杆菌占59.61%。那曲地区的鲜样发酵14天后食窦魏斯氏菌占33.83%,发酵中后期乳杆菌占比47.51%、73.57%、68.87%。4.本试验从不同地区不同发酵阶段的垂穗披碱草青贮饲料中共分离得到优势乳酸菌92株,分为乳杆菌属(Lactobacillus)和片球菌属(Pediococcus),其中又包括了4个种:植物乳杆菌(Lactobucillus plantarum)13株,乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)50株,短乳杆菌(Lactobacillus brevis)28株,副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)1株。通过对92株优势乳酸菌进行产酸能力和耐低温能力的筛选得到6株表现突出的乳酸菌,分别是短乳杆菌(LB-40、LB-59)、乳酸片球菌(PA-60、PA-69、PA-87)和植物乳杆菌(LP-66),其中LP-66在10和15℃条件下显著降低了绿汁发酵液的pH值(P0.05);PA-87和LP-66在15、25℃条件下长势最好。就糖发酵能力来说,PA-87与实验室分离菌及标准菌相比有较强的糖源利用能力;就不同环境乳酸菌的生长能力来说,所有乳酸菌的生长温度范围都在10-50℃之间,所有乳酸菌的生长pH范围都在3.5-9.0之间。但是青藏高原分离乳酸菌与购买的标准菌在具体的生长情况中存在明显的差异。5.将筛选得到的一株植物乳杆菌LP-66与购自美国的植物乳杆菌(ALP)同时作为青贮添加剂添加到垂穗披碱草青贮30天后发现:10℃条件下LP-66组的乳酸含量显著高于对照组及ALP处理组,在15℃条件下LP-66组比ALP处理组保存了更多的粗蛋白,同时ADF和NDF含量也显著低于ALP处理组;对青贮60天的样品进行品质测定发现:在10℃和25℃条件下LP-66处理组的pH值显著低于对照组及ALP处理组;在25℃条件下LP-66处理组未检测到酵母菌和霉菌。综上结果可以初步断定,相对于商品菌株,本研究分离筛选的植物乳杆菌在LP-66在低温条件下表现出了一定的发酵优势,可作为在青藏高原低温条件调制青贮饲料的备选菌株。
【关键词】：青藏高原 垂穗披碱草 青贮 乳酸菌 多样性 低温发酵
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S816.53
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 文献综述11-22
• 1.1 青藏高原高寒草地现状11
• 1.2 乳酸菌概述11-16
• 1.2.1 乳酸菌的分类12
• 1.2.2 乳酸菌的功能12-13
• 1.2.3 青贮用乳酸菌的种类13-14
• 1.2.4 青贮用乳酸菌添加剂的筛选14-15
• 1.2.5 产阿魏酸酯酶的乳酸菌的研究15
• 1.2.6 耐低温乳酸菌的研究进展15-16
• 1.3 青贮饲料概述16-19
• 1.3.1 青贮的优点16-17
• 1.3.2 青贮的发酵过程17
• 1.3.3 青贮添加剂的应用17-18
• 1.3.4 影响青贮发酵品质的因素18-19
• 1.4 立题依据19-21
• 1.5 研究思路21-22
• 第二章 青藏高原不同地区垂穗披碱草青贮饲料中乳酸菌多样性研究22-36
• 2.1 引言22
• 2.2 试验材料及仪器22-34
• 2.2.1 试验材料22
• 2.2.2 试验试剂22-23
• 2.2.3 试验仪器23
• 2.2.4 试验方法23-24
• 2.2.5 结果与讨论24-34
• 2.3 小结34-36
• 第三章 青藏高原不同地区垂穗披碱草青贮饲料中优势乳酸菌的筛选及生理生化特性研究36-56
• 3.1 引言36
• 3.2 试验材料和仪器36-38
• 3.2.1 试验原料36
• 3.2.2 试验试剂36-37
• 3.2.3 试验器材37-38
• 3.2.4 培养基的配制38
• 3.3 试验方法38-40
• 3.3.1 菌种分离纯化38
• 3.3.2 乳酸菌DNA的提取38
• 3.3.3 乳酸菌的 16SrRNA序列扩增38
• 3.3.4 序列比对38
• 3.3.5 Species-specific PCR38
• 3.3.6 MRS培养基初筛38-39
• 3.3.7 绿汁发酵液复筛39
• 3.3.8 产阿魏酸酯酶乳酸菌的初筛39
• 3.3.9 糖发酵，硝酸盐还原，精氨酸产氨及葡萄糖产气39
• 3.3.10 不同pH值和不同温度条件下乳酸菌的生长特性测定39
• 3.3.11 乳酸菌的生长曲线及产酸曲线的测定39
• 3.3.12 数据分析39-40
• 3.4 结果与讨论40-55
• 3.4.1 青藏高原不同地区不同发酵阶段垂穗披碱草青贮饲料中优势乳酸菌的鉴定结果40-42
• 3.4.2 优势乳酸菌的产酸能力筛选结果（MRS培养基初筛）42-46
• 3.4.3 优势乳酸菌的耐低温能力筛选结果（绿汁发酵液筛选）46-47
• 3.4.4 产阿魏酸酯酶乳酸菌的筛选47
• 3.4.5 优良乳酸菌的产酸能力及耐低温能力47-49
• 3.4.6 优良乳酸菌的生理生化特性49-55
• 3.5 小结55-56
• 第四章 青藏高原优良乳酸菌的发酵特性研究56-63
• 4.1 引言56
• 4.2 试验材料和仪器56-57
• 4.2.1 试验试剂56
• 4.2.2 实验主要仪器56-57
• 4.3 试验方法57-58
• 4.3.1 青贮的制作57
• 4.3.2 青贮微生物计数57
• 4.3.3 青贮品质及化学成分的测定57-58
• 4.4 试验结果与讨论58-62
• 4.4.1 青贮前垂穗披碱草原料各项指标58-59
• 4.4.2 青贮30天后垂穗披碱草青贮各项指标59-61
• 4.4.3 青贮60天后垂穗披碱草青贮各项指标61-62
• 4.5 小结62-63
• 第五章 结论63-64
• 参考文献64-69
• 研究成果69-70
• 致谢70

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