猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究

发布时间：2022-12-05 20:14

　　猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）属于细小病毒科、细小病毒亚科、细小病毒属病毒,是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,临床表现为初孕母猪不孕、流产、产木乃伊胎和死胎等现象。PPV在全球大部分地区呈地方性流行,在未接种疫苗或疫苗接种不当的猪群中可造成毁灭性的流产风暴。大量研究报道,PPV感染可引起胎儿或仔猪的多种组织脏器发生损伤进而引起胎儿死亡或产弱仔等,并以此解释PPV诱导繁殖障碍的原因,但是,关于PPV感染对妊娠母体的影响却鲜有报道。卵巢黄体是建立和维持妊娠的重要组织,主要通过黄体细胞合成孕酮以维持正常的妊娠。已有研究报道,PPV感染可导致母体黄体组织受损,进而引起不孕和流产等病理现象的发生,但其具体作用分子机制尚不清楚。本研究首先建立永生化黄体细胞系,为后续研究提供可靠的细胞模型。然后用PPV分别感染原代和永生化猪黄体细胞,检测PPV感染诱导黄体细胞凋亡和凋亡信号转导通路,明确PPV感染抑制黄体细胞孕酮产生及相应机制。最后,PPV感染初孕母猪,从体内水平进一步验证PPV感染诱导黄体细胞凋亡的信号转导通路和抑制孕酮产生的机制。旨在从体外和体内水平探讨PPV感染诱导... 

【文章页数】：111 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
文献综述
    第一章 病毒诱导宿主细胞凋亡研究进展
        1.1 病毒感染诱导细胞凋亡
            1.1.1 病毒量与细胞凋亡
            1.1.2 病毒抗体与细胞凋亡
        1.2 病毒感染诱导细胞凋亡的信号转导通路
            1.2.1 病毒感染诱导死亡受体通路研究
            1.2.2 病毒感染诱导线粒体通路研究
            1.2.3 病毒感染诱导p53信号转导通路研究
            1.2.4 病毒感染诱导MAPKs信号转导通路研究
        1.3 细小病毒诱导的细胞凋亡
        1.4 本研究的目的意义
试验研究
    第二章 永生化猪黄体细胞系的建立与鉴定
        2.1 试验材料
            2.1.1 卵巢组织
            2.1.2 实验动物
            2.1.3 质粒和细胞
            2.1.4 主要试剂
            2.1.5 主要试剂的配置
            2.1.6 主要仪器
        2.2 试验方法
            2.2.1 原代猪黄体细胞的分离、纯化
            2.2.2 3β-HSD活性染色和Oil-Red-O染色鉴定
            2.2.3 猪黄体细胞的永生化
            2.2.4 转染后的猪黄体细胞端粒酶基因表达及活性鉴定
            2.2.5 核型分析
            2.2.6 透射电子显微镜观察
            2.2.7 3β-HSD活性染色和Oil-Red-O染色鉴定转染后黄体细胞
            2.2.8 台盼蓝法鉴定细胞活性
            2.2.9 RT-PCR法检测类固醇激素合成相关分子的表达
            2.2.10 放射免疫法检测LH和氯前列烯醇刺激后孕酮的产生
            2.2.11 Westernblotting法检测LH和氯前列烯醇刺激后孕酮合成过程中关键蛋白和酶的表达
            2.2.12 软琼脂试验及裸鼠致瘤试验
            2.2.13 统计学分析
        2.3 结果
            2.3.1 永生化猪黄体细胞系的建立
            2.3.2 永生化猪黄体细胞形态学特征的鉴定
            2.3.3 类固醇激素合成过程中相关分子的表达
            2.3.4 LH和氯前列烯醇对黄体细胞孕酮合成的影响
            2.3.5 体内和体外致瘤性分析
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第三章 猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡信号转导通路研究
        3.1 试验材料
            3.1.1 病毒和细胞
            3.1.2 主要试剂
            3.1.3 主要仪器
        3.2 试验方法
            3.2.1 PPV的扩增及病毒滴度的测定
            3.2.2 MTT法检测PPV对黄体细胞细胞活性的影响
            3.2.3 qPCR法检测PPV在黄体细胞中的增殖
            3.2.4 PPV感染对黄体细胞损伤的形态观察
            3.2.5 DNA片段化分析
            3.2.6 流式细胞术检测
            3.2.7 分光光度法检测caspase的活性
            3.2.8 抑制剂预处理猪黄体细胞
            3.2.9 Westernblotting法检测死亡受体和线粒体通路主要相关蛋白的表达
            3.2.10 RT-PCR法检测p53转录水平的变化
            3.2.11 Westernblotting法检测p53蛋白表达和转位以及p38MAPK、JNK总蛋白和蛋白磷酸化水平变化情况
            3.2.12 p53siRNA转染猪黄体细胞
            3.2.13 统计学分析
        3.3 结果
            3.3.1 PPV感染对黄体细胞活性的影响
            3.3.2 PPV在黄体细胞中的增殖
            3.3.3 PPV感染诱导原代和永生化黄体细胞凋亡
            3.3.4 PPV感染经线粒体通路诱导原代和永生化黄体细胞凋亡
            3.3.5 p53参与调控PPV诱导的黄体细胞凋亡
            3.3.6 PPV诱导黄体细胞中的p38MAPK发生磷酸化
            3.3.7 磷酸化p38参与调控PPV感染引起的黄体细胞凋亡
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 猪细小病毒抑制猪黄体细胞孕酮产生机制研究
        4.1 试验材料
            4.1.1 病毒和细胞
            4.1.2 主要试剂
        4.2 试验方法
            4.2.1 放射免疫法检测孕酮的产生
            4.2.2 Real-timePCR法检测黄体细胞中孕酮合成关键蛋白和酶的表达
            4.2.3 Westernblotting法检测黄体细胞中孕酮合成关键蛋白和酶的表达
            4.2.4 放射免疫法检测特异性抑制剂预处理后PPV感染对黄体细胞孕酮产生的影响
            4.2.5 统计学分析
        4.3 结果
            4.3.1 PPV感染抑制原代和永生化黄体细胞孕酮产生
            4.3.2 PPV感染对黄体细胞孕酮合成的影响
            4.3.3 调控PPV感染诱导黄体细胞凋亡过程的相关因子对黄体细胞孕酮产生的影响
        4.4 讨论
        4.5 小结
    第五章 猪细小病毒感染诱导初孕母猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生研究
        5.1 试验材料
            5.1.1 病毒和细胞
            5.1.2 实验动物
            5.1.3 主要试剂
            5.1.4 主要试剂的配置
            5.1.5 主要仪器
        5.2 试验方法
            5.2.1 人工感染PPV
            5.2.2 血清中PPV抗体水平的检测
            5.2.3 血清中孕酮含量的检测
            5.2.4 原位杂交法检测PPV在黄体组织中的分布及复制情况的确定
            5.2.5 Westernblotting法检测黄体组织中PPV的表达
            5.2.6 HE染色
            5.2.7 TUNEL染色
            5.2.8 透射电子显微镜观察黄体组织细胞超微结构变化
            5.2.9 Westernblotting法检测黄体组织中细胞凋亡信号转导通路主要相关蛋白的表达
            5.2.10 Real-timePCR法检测黄体组织中孕酮合成过程中关键蛋白和酶基因的表达
            5.2.11 Westernblotting法检测黄体组织中孕酮合成过程中关键蛋白及酶的表达.
            5.2.12 统计学分析
        5.3 结果
            5.3.1 人工感染PPV不同时间妊娠猪血清中PPV抗体水平的变化
            5.3.2 人工感染PPV不同时间妊娠猪血清中孕酮水平的变化
            5.3.3 人工感染PPV不同时间对初孕猪卵巢大体剖检观察结果
            5.3.4 人工感染PPV后PPV在黄体组织中复制及病毒载量的观察
            5.3.5 人工感染PPV不同时间对初孕母猪黄体组织损伤和细胞凋亡的影响
            5.3.6 人工感染PPV对初孕母猪黄体组织细胞超微结构的影响
            5.3.7 人工感染PPV通过线粒体通路介导黄体组织中细胞凋亡
            5.3.8 人工感染PPV促进p53蛋白在黄体组织细胞中的积累
            5.3.9 人工感染PPV诱导黄体组织细胞中p38蛋白发生磷酸化
            5.3.10 人工感染PPV不同时间对初孕母猪黄体组织中孕酮合成相关蛋白和酶表达的影响
        5.4 讨论
        5.5 小结
结论
创新点
参考文献
英文缩略词及中英文对照
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]Regulation of Hepatitis C Virus Replication and Gene Expression by the MAPK-ERK Pathway[J]. Michael Roggendorf.  Virologica Sinica. 2012(05)



本文编号：3710278