三肽囊素单克隆抗体的制备及其噬菌体七肽模拟表位的筛选
发布时间：2024-03-10 10:02
三肽囊素(赖氨酰-组氨酰-甘氨酰胺，KHG-NH2，Bursin)是一种从鸡法氏囊中纯化到的三肽物质，具有诱导B淋巴细胞的分化、提高机体抗体水平、促进T淋巴细胞转化活性、抑制细胞凋亡等作用。基于三肽囊素对畜禽的免疫增强作用，大量的研究集中于将其作为一种免疫增强剂应用于畜禽生产，由于从禽法氏囊提取的数量有限、化学合成成本高等原因，难以在畜禽生产中广泛应用。本研究诣在研制高亲和力三肽囊素单克隆抗体基础上，从噬菌体随机肽库中筛选具有免疫增强活性的三肽囊素模拟表位，以期作为三肽囊素免疫增强活性的功能替代品在畜禽生产中的应用打下基础。 1.三肽囊素人工抗原的制备 三肽囊素分子上有多个氨基可用于与载体蛋白偶联，载体蛋白与不同位置氨基偶联制备的人工抗原免疫小鼠均可能获得抗三肽囊素抗体，虽然大部分抗体适合用于建立三肽囊素的免疫学检测方法，但以不同单抗为配体筛选的噬菌体模拟表位的生物学特性可能存在较大差异。 (1)分别采用EDC法和SMCC法将三肽囊素分子赖氨酰(K)上的氨基分别与载体蛋白(BSA、OVA)的羧基发生定向偶联制备人工抗原BSA-KHG-NH2、...
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩写词表
第一章 文献综述
1.1 三肽囊素（Bursin）的研究进展
1.1.1 前言
1.1.2 BF 形态学的研究简况
1.1.3 法氏囊（BF）提取物中免疫活性因子研究进展
1.1.4 法氏囊三肽囊素（Bursin）的研究
1.2 噬菌体展示技术的研究与进展
1.2.1 噬菌体表面展示技术的方法与发展
1.2.2 噬菌体肽库的应用
第二章 三肽囊素人工抗原及其单克隆抗体的研制（一）
2.1 主要试剂与材料
2.2 实验方法
2.2.1 三肽囊素人工抗原的制备
2.2.2 抗三肽囊素多克隆抗体的制备
2.2.3 抗三肽囊素单克隆抗体的制备
2.3 结果与分析
2.3.1 三肽囊素人工抗原的制备
2.3.2 免疫小鼠抗体效价及特异性测定
2.3.3 细胞融合及杂交瘤细胞筛选
2.3.4 杂交瘤细胞亚克隆及上清抗体效价检测
2.3.5 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测
2.3.6 单克隆抗体的大量制备和纯化
2.3.7 抗三肽囊素单克隆抗体特性测定
2.3.8 三肽囊素间接竞争抑制曲线的建立
2.3.9 加标回收率的测定及鸡法氏囊样品中三肽囊素含量的检测
2.4 讨论
2.4.1 小分子半抗原与载体蛋白
2.4.2 偶联完全抗原的检测
2.4.3 小分子偶联基团的选择
2.4.4 细胞融合及培养
2.4.5 杂交瘤细胞的检测及亚克隆
2.4.6 抗原的定向偶联及不同杂交瘤细胞株间的差异
2.5 小结
第三章 三肽囊素人工抗原及其单克隆抗体的研制（二）
3.1 主要试剂与材料
3.2 实验方法
3.2.1 三肽囊素人工抗原的合成
3.2.2 三肽囊素多克隆抗体的制备
3.2.3 三肽囊素单克隆抗体的制备
3.3 实验结果与分析
3.3.1 免疫小鼠抗原制备的鉴定
3.3.2 三肽囊素多克隆抗体特异性检测
3.3.3 细胞融合及杂交瘤细胞筛选
3.4 讨论
第四章 三肽囊素噬菌体模拟表位的筛选
4.1 实验材料与试剂
4.2 方法
4.2.1 受体菌 E.coli ER2738 生长曲线的绘制
4.2.2 Bursin 噬菌体七肽模拟表位淘洗
4.2.3 噬菌体滴度的测定
4.2.4 噬菌斑的扩增与纯化
4.2.5 阳性噬菌体克隆筛选
4.2.6 阳性噬菌体克隆的 DNA 模板提取
4.2.7 28个噬菌体克隆滴度测定
4.2.8 阳性噬菌体克隆效价测定
4.2.9 噬菌体间接竞争曲线的绘制
4.2.10 过滤后噬菌体滴度检测
4.2.11 阳性噬菌体对 P35 杂交瘤细胞抗体分泌的影响
4.3 结果与分析
4.3.1 受体菌 E.coli ER2738 生长曲线的测定结果
4.3.2 亲和淘洗结果
4.3.3 噬菌体的扩增与纯化
4.3.4 噬菌体克隆阳性筛选结果
4.3.5 噬菌体单链 DNA 提取
4.3.6 噬菌体克隆滴度测定结果
4.3.7 方阵滴定法测定结果
4.3.8 噬菌体抗体效价测定结果
4.3.9 阳性噬菌体克隆特性测定
4.3.10 过滤后噬菌体滴度的测定结果
4.3.11 P35 单克隆抗体标准曲线的建立及细胞浓度的摸索
4.3.12 阳性噬菌体对杂交瘤抗体分泌的影响
4.4 讨论
4.4.1 抗三肽囊素单克隆抗体 2D2 七肽模拟表位的筛选
4.4.2 竞争 ELISA 方法鉴定特异性结合肽的活性
4.4.3 三肽囊素及其它几种合成肽对杂交瘤抗体分泌影响
4.4.4 噬菌体对杂交瘤细胞抗体分泌的影响
4.5 小结
全文总结
参考文献
致谢
个人简介
本文编号：3924623
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩写词表
第一章 文献综述
1.1 三肽囊素（Bursin）的研究进展
1.1.1 前言
1.1.2 BF 形态学的研究简况
1.1.3 法氏囊（BF）提取物中免疫活性因子研究进展
1.1.4 法氏囊三肽囊素（Bursin）的研究
1.2 噬菌体展示技术的研究与进展
1.2.1 噬菌体表面展示技术的方法与发展
1.2.2 噬菌体肽库的应用
第二章 三肽囊素人工抗原及其单克隆抗体的研制（一）
2.1 主要试剂与材料
2.2 实验方法
2.2.1 三肽囊素人工抗原的制备
2.2.2 抗三肽囊素多克隆抗体的制备
2.2.3 抗三肽囊素单克隆抗体的制备
2.3 结果与分析
2.3.1 三肽囊素人工抗原的制备
2.3.2 免疫小鼠抗体效价及特异性测定
2.3.3 细胞融合及杂交瘤细胞筛选
2.3.4 杂交瘤细胞亚克隆及上清抗体效价检测
2.3.5 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测
2.3.6 单克隆抗体的大量制备和纯化
2.3.7 抗三肽囊素单克隆抗体特性测定
2.3.8 三肽囊素间接竞争抑制曲线的建立
2.3.9 加标回收率的测定及鸡法氏囊样品中三肽囊素含量的检测
2.4 讨论
2.4.1 小分子半抗原与载体蛋白
2.4.2 偶联完全抗原的检测
2.4.3 小分子偶联基团的选择
2.4.4 细胞融合及培养
2.4.5 杂交瘤细胞的检测及亚克隆
2.4.6 抗原的定向偶联及不同杂交瘤细胞株间的差异
2.5 小结
第三章 三肽囊素人工抗原及其单克隆抗体的研制（二）
3.1 主要试剂与材料
3.2 实验方法
3.2.1 三肽囊素人工抗原的合成
3.2.2 三肽囊素多克隆抗体的制备
3.2.3 三肽囊素单克隆抗体的制备
3.3 实验结果与分析
3.3.1 免疫小鼠抗原制备的鉴定
3.3.2 三肽囊素多克隆抗体特异性检测
3.3.3 细胞融合及杂交瘤细胞筛选
3.4 讨论
第四章 三肽囊素噬菌体模拟表位的筛选
4.1 实验材料与试剂
4.2 方法
4.2.1 受体菌 E.coli ER2738 生长曲线的绘制
4.2.2 Bursin 噬菌体七肽模拟表位淘洗
4.2.3 噬菌体滴度的测定
4.2.4 噬菌斑的扩增与纯化
4.2.5 阳性噬菌体克隆筛选
4.2.6 阳性噬菌体克隆的 DNA 模板提取
4.2.7 28个噬菌体克隆滴度测定
4.2.8 阳性噬菌体克隆效价测定
4.2.9 噬菌体间接竞争曲线的绘制
4.2.10 过滤后噬菌体滴度检测
4.2.11 阳性噬菌体对 P35 杂交瘤细胞抗体分泌的影响
4.3 结果与分析
4.3.1 受体菌 E.coli ER2738 生长曲线的测定结果
4.3.2 亲和淘洗结果
4.3.3 噬菌体的扩增与纯化
4.3.4 噬菌体克隆阳性筛选结果
4.3.5 噬菌体单链 DNA 提取
4.3.6 噬菌体克隆滴度测定结果
4.3.7 方阵滴定法测定结果
4.3.8 噬菌体抗体效价测定结果
4.3.9 阳性噬菌体克隆特性测定
4.3.10 过滤后噬菌体滴度的测定结果
4.3.11 P35 单克隆抗体标准曲线的建立及细胞浓度的摸索
4.3.12 阳性噬菌体对杂交瘤抗体分泌的影响
4.4 讨论
4.4.1 抗三肽囊素单克隆抗体 2D2 七肽模拟表位的筛选
4.4.2 竞争 ELISA 方法鉴定特异性结合肽的活性
4.4.3 三肽囊素及其它几种合成肽对杂交瘤抗体分泌影响
4.4.4 噬菌体对杂交瘤细胞抗体分泌的影响
4.5 小结
全文总结
参考文献
致谢
个人简介
本文编号：3924623
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