植物乳杆菌DPP8胆盐水解酶基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质

发布时间：2024-03-31 17:06

　　本试验旨在克隆植物乳杆菌DPP8胆盐水解酶(BSH)基因并在大肠杆菌表达系统对其进行表达,同时探讨其酶学性质。通过PCR技术克隆植物乳杆菌DPP8 BSH基因,然后将该基因重组到大肠杆菌表达载体pET32a(+)中,获得重组表达载体pET32a(+)-BSH,再将其转化至大肠杆菌BL21中,通过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达BSH。采用牛磺酸标准液标定法对表达的BSH的活性进行测定,并对其酶学性质进行研究。结果显示:本试验获得了BSH基因全长975 bp的序列,同源性比较和系统进化树分析表明成功获得了BSH基因。对BSH表达产物的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示获得了1条约为56 ku的蛋白条带,与预期蛋白分子质量大小相符。重组菌株在37℃、0.1 mmol/L IPTG诱导6 h时BSH活性最高,可达22.81 U/mL。纯化的BSH的最适反应温度为37℃,最适反应pH为6.5,在40℃以下时具有较好的热稳定性,pH在3.0～9.0时可保持90%以上的活性。镁离子(Mg²⁺)、铝离子(Al³⁺)、三价铁离子(...

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【部分图文】：

图1BSH基因PCR扩增结果

以植物乳杆菌DPP8全基因组DNA为模板，经PCR扩增后，产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，如图1所示，在约975bp处有1条特异性条带，与预期大小相符。2.2克隆质粒pMD18-BSH的鉴定结果

图2质粒pMD18-BSHPCR扩增产物及酶切鉴定

以pMD18-BSH质粒为模板，通过PCR扩增出1条约为975bp的条带（图2中泳道1），与目的基因大小相符；将质粒pMD18-BSH用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，在1.0%的琼脂糖凝胶上显示出2条条带（图2中泳道3），大小分别约为975和2692bp，结果与目的基因大小....

图3基于Neighbor-Joining法构建植物乳杆菌DPP8BSH基因序列系统进化树分析

由图4可知，重组质粒pET32a(+)-BSH经PCR扩增出1条975bp的条带，与目的条带大小相符；经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后分别得到2条大小分别约为5900和975bp的条带，经EcoRⅠ单酶切得到1条大小约为6900bp条带。上述结果说明BSH基因已插入表达载....

图4重组质粒pET32a(+)-BSHPCR扩增产物及酶切鉴定

重组大肠杆菌经不同时间诱导，分别取不同诱导时间的大肠杆菌裂解液，采用牛磺酸标准液标定法进行BSH活性的测定，结果见图6。重组菌株BL21/pET32a(+)-BSH在培养0～6h时BSH活性不断升高，培养到6h时BSH活性达到最大值22.81U/mL，但在诱导4h后活性已....

本文编号：3944244