表达NDV HN和IBDV VP2融合蛋白重组减毒沙门菌的构建及其特性研究

发布时间：2024-04-09 19:04

　　鸡新城疫(Newcastle disease,ND)作为OIE A类疾病,鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)作为B类传染病,给全球养禽业造成巨大的经济损失。在我国,鸡新城疫与传染性法氏囊病一直是严重危害养禽业发展的重要传染病。鸡新城疫传染性强、死亡率高,且感染宿主范围越来越广。鸡传染性法氏囊病主要破坏鸡的体液免疫中枢器官—法氏囊,导致淋巴细胞功能受损,引起鸡体的免疫抑制,从而影响新城疫、禽流感等疫苗的免疫效果。当前由于NDV及IBDV变异株、超强毒株和新毒株的流行,导致传统疫苗免疫效果有所降低,因此,研发防控ND和IBD的新型疫苗显得尤为重要。减毒沙门菌作为疫苗活载体是一种天然的黏膜免疫增强剂,可以实现多种抗原的递呈,经口服免疫可诱导机体产生特异性的的黏膜、体液和细胞免疫应答。因此,本研究采用asd+宿主-载体平衡致死系统,将NDV HN和IBDV VP2基因串联克隆至无抗性表达载体pYA3493中,并电转化至减毒鼠伤寒沙门菌,成功构建了表达HN和VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌候选疫苗,对其生物学及免疫学特性进行研究,为新城疫-传染性法氏囊-...

【文章页数】：89 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
符号表
第1章 文献综述
    1.1 鸡新城疫研究进展
        1.1.1 ND病原学研究
        1.1.2 NDV分子生物学研究
        1.1.3 ND流行病学研究
        1.1.4 ND的诊断与防制
    1.2 鸡传染性法氏囊研究进展
        1.2.1 IBD病原学研究
        1.2.2 IBD流行病学研究
        1.2.3 IBD的诊断
        1.2.4 IBD的防治
    1.3 减毒沙门菌作为疫苗活载体的研究进展
        1.3.1 沙门菌减毒的相关基因
        1.3.2 减毒沙门菌诱导的免疫应答
        1.3.3 减毒沙门菌载体的优缺点
        1.3.4 减毒沙门菌载体的应用
    1.4 展望
第2章 NDV HN和IBDV VP2融合蛋白的原核表达及鉴定
    2.1 材料
        2.1.1 菌株及质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要培养基、试剂的配制
        2.1.4 主要实验器材
    2.2 方法
        2.2.1 目的基因的扩增
        2.2.2 目的基因的回收
        2.2.3 融合基因片段的获取
        2.2.4 DH5α感受态细胞的制备
        2.2.5 重组质粒pMD19-T-HN-VP2的构建
        2.2.6 重组质粒的提取
        2.2.7 重组质粒pMD19-T-HN-VP2的鉴定
        2.2.8 重组质粒pET32a-HN-VP2的构建及鉴定
        2.2.9 融合蛋白的表达及鉴定
    2.3 结果与分析
        2.3.1 HN基因片段及VP2主要抗原片段的扩增
        2.3.2 融合基因HN-VP2扩增结果
        2.3.3 重组质粒pMD19-T-HN-VP2的PCR鉴定
        2.3.4 重组质粒pMD19-T-HN-VP2的双酶切鉴定
        2.3.5 重组质粒pET32a-HN-VP2的PCR鉴定
        2.3.6 重组质粒pET32a-HN-VP2的双酶切鉴定
        2.3.7 SDS-PAGE检测HN-VP2融合蛋白的表达
        2.3.8 Western Blot检测结果
    2.4 讨论
第3章 表达NDV HN和IBDV VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌的构建及生物学特性分析
    3.1 材料
        3.1.1 菌株及质粒
        3.1.2 试剂及培养基
        3.1.3 试剂及培养基配制方法
        3.1.4 实验动物
        3.1.5 实验器材
    3.2 方法
        3.2.1 HN-VP2融合基因的获取
        3.2.2 重组质粒pMD19-T-HN-VP2的构建
        3.2.3 重组质粒pMD19-T-HN-VP2的鉴定
        3.2.4 重组载体pYA-HN-VP2的构建
        3.2.5 沙门菌（SL1344Δcrp?cya?asd）感受态的制备
        3.2.6 沙门菌的电转化
        3.2.7 重组菌SL1344Δcrp?cya?asd (pYA-HN-VP2)的鉴定
        3.2.8 重组菌SL1344Δcrp?cya?asd (pYA-HN-VP2)的表型及生化鉴定
        3.2.9 重组菌 SL1344Δcrp?cya?asd (p YA-HN-VP2)的生长特性测定
        3.2.10 融合基因在重组菌株中的遗传稳定性检测
        3.2.11 重组蛋白在沙门菌中的表达及鉴定
        3.2.12 重组菌SL1344Δcrp?cya?asd (pYA-HN-VP2)对雏鸡的毒力试验
    3.3 结果
        3.3.1 重组菌SL1344Δcrp?cya?asd (pYA-HN-VP2)的PCR鉴定
        3.3.2 重组菌SL1344Δcrp?cya?asd (pYA-HN-VP2)的双酶切鉴定
        3.3.3 重组菌SL1344Δcrp?cya?asd (pYA-HN-VP2)的表型及生化鉴定
        3.3.4 重组菌 SL1344Δcrp?cya?asd (p YA-HN-VP2)的生长曲线测定
        3.3.5 重组菌的遗传稳定性检测
        3.3.6 融合蛋白在重组菌中的表达
        3.3.7 重组菌株对雏鸡的毒力试验
    3.4 讨论
第4章 减毒重组菌SL1344Δcrp?cya?asd(pYA-HN-VP2)的免疫学特性研究
    4.1 材料
        4.1.1 菌株
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要试剂的配制
        4.1.4 实验动物
        4.1.5 仪器设备
    4.2 方法
        4.2.1 雏鸡的免疫
        4.2.2 雏鸡免疫后的体重变化
        4.2.3 免疫雏鸡的免疫器官指数测定
        4.2.4 NDV抗体水平测定
        4.2.5 间接ELISA法检测IBDV VP2抗体水平
        4.2.6 淋巴细胞增殖活性检测
        4.2.7 免疫雏鸡消化道sIgA抗体水平的测定
        4.2.8 免疫雏鸡血清中IFN-γ水平的测定
        4.2.9 免疫雏鸡血清中IL-4 水平的测定
        4.2.10 重组菌株对鸡的免疫保护效力试验
        4.2.11 数据分析
    4.3 结果
        4.3.1 雏鸡体重变化测定
        4.3.2 免疫雏鸡免疫器官指数的测定
        4.3.3 免疫雏鸡体内新城疫HI抗体水平的测定
        4.3.4 免疫雏鸡体内鸡传染性法氏囊VP2抗体水平的测定
        4.3.5 淋巴细胞增殖试验
        4.3.6 免疫雏鸡消化道sIgA抗体水平的测定
        4.3.7 免疫雏鸡血清中IFN-γ水平的测定
        4.3.8 免疫雏鸡血清中IL-4 水平的测定
        4.3.9 重组菌对鸡的免疫保护效力试验
    4.4 讨论
第5章 结论
参考文献
附录Ⅰ 主要仪器设备
附录Ⅱ HN-VP2测序结果
致谢
硕士期间的研究成果



本文编号：3949512