柔嫩艾美耳球虫组蛋白去乙酰化酶3（EtHDAC3）生化特征的研究

发布时间：2024-06-16 08:17

　　球虫是对养鸡业危害最大的病原体之一。尽管“以饲料厂为中心的药物预防体系”对球虫病控制和集约化养鸡生产发展发挥了不可或缺的保障作用,但随着鸡球虫抗药性的普遍产生,迫切需要寻找新的药物作用靶标分子,开发新型药物。其它寄生原虫的研究业已表明,组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是颇具应用前景的药物靶标。HDAC3是I型HDACs家族的成员之一,主要作用于H2A、H4组蛋白等,是重要的药物靶标。对柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)的HDAC3(EtHDAC3)的研究不仅能发现其在球虫生活史调控机制中的作用,还可为研制新型抗球虫药、新型疫苗奠定理论基础。 本研究通过生物信息学方法预测EtHDAC3基因并设计引物,以E. tenella广东株裂殖子总RNA为模板,用RT-PCR方法获得其序列,结果显示克隆的序列由1200个核苷酸组成,编码399个氨基酸。通过生物信息学方法对E.tenella进行结构和功能分析,结果显示EtHDAC3具有完整的I型HDACs的结构域,并与其它顶复门生物具有高度保守性,序列相似性达到90%左右。 本研究以原核表达载体pMAL-C2X构建重组质粒pMAL-C2X-...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 HDACs的功能
    1.2 HDACs分类与结构
    1.3 HDACs的三维结构和催化机理
    1.4 机体对HDACs的调控
    1.5 HDACs抑制剂
    1.6 HDACs在寄生原虫中的研究进展
        1.6.1 疟原虫的HDACs
        1.6.2 弓形虫HDACs
        1.6.3 锥虫HDACs
        1.6.4 溶组织内阿米巴原虫HDACs
        1.6.5 利什曼原虫HDACs
    1.7 艾美耳球虫HDACs研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 虫种、菌株和载体
        2.1.2 试验动物
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 主要试剂
        2.1.5 引物
    2.2 方法
        2.2.1 EtHDAC3基因的克隆
        2.2.2 EtHDAC3基因的诱导表达
        2.2.3 E.tenella不同发育阶段EtHDAC3基因转录的变化
        2.2.4 利用同源模建和分子对接分析EtHDAC3和ChHDAC3的活性位点
3 结果
    3.1 EtHDAC3基因ORF的克隆
        3.1.1 EtHDAC3基因ORF的预测
        3.1.2 E.tenella第二代裂殖子总RNA提取结果
        3.1.3 EtHDAC3的RT-PCR结果
        3.1.4 转化菌落的PCR鉴定
        3.1.5 测序结果
        3.1.6 EtHDAC3信号肽序列预测结果
        3.1.7 EtHDAC3 NLS和NES的预测
        3.1.8 各顶复门原虫HDAC3氨基酸序列的比对结果
    3.2. EtHDAC3基因的诱导表达
        3.2.1 带有酶切位点的EtHDAC3基因的扩增及鉴定
        3.2.2 重组质粒的酶切鉴定
        3.2.3 EtHDAC3基因的诱导表达结果
        3.2.4 pMAL-C2X-EtHDAC3不同温度的诱导表达
        3.2.5 pMAL-C2X-EtHDAC3不同IPTG浓度的诱导表达
    3.3 E.tenella不同发育阶段EtHDAC3基因转录的变化
        3.3.1 各个时期总RNA的提取结果
        3.3.2 引物的检验
        3.3.3 EtHDAC3和β-actin的扩增效率、标准曲线和溶解曲线
        3.3.4 待测样品EtHDAC3和β-actin Real-time RT-PCR结果
    3.4 利用同源模建和分子对接分析EtHDAC3和ChHDAC3的活性位点的差异
        3.4.1 ChHDAC3基因的扩增及鉴定
        3.4.2 EtHDAC3和ChHDAC3的活性位点的分析
        3.4.3 同源建模
        3.4.4 分子对接
4 讨论
    4.1 EtHDAC3的克隆与表达
    4.2 E.tenella不同发育阶段EtHDAC3基因转录的变化
    4.3 利用同源模建和分子对接分析EtHDAC3和ChHDAC3的活性位点的差异
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文



本文编号：3995135