甲基苯丙胺对学习记忆的影响及其与VGLUT-1的相关性研究

发布时间：2017-03-17 07:05

  本文关键词：甲基苯丙胺对学习记忆的影响及其与VGLUT-1的相关性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究意义与目的:甲基苯丙胺(Methamphetamine,MA)是一种滥用程度极为严重的中枢兴奋剂,其使用范围遍布全球。在我国,MA等中枢兴奋剂消耗量的增速已经超过海洛因、大麻等传统毒品,而且使用范围非常广,遍布30多个省市。MA长期滥用可以产生严重的神经毒性,导致认知功能下降,罹患精神性疾病的可能性增大,产生异常情绪及行为。其中认知功能低下主要表现在学习记忆功能、辨识能力以及控制能力的损伤;但是小剂量MA也曾被作为益智药的成分使用。目前,不同程度的MA滥用对学习记忆功能产生何种影响不是十分明确,长期使用MA导致的学习记忆功能障碍的机制仍不十分清楚,尚无有效的防治药物。近些年,越来越多的研究表明,谷氨酸(Glutamic acid,Glu)能神经系统传递异常在MA长期神经毒性导致学习记忆等认知功能障碍中有非常重要的作用。谷氨酸转运体是Glu能传递系统的重要组成部分,分为质膜型和囊泡型。其中囊泡谷氨酸转运体(Vesicular glutamate transporters,VGLUTs)的功能是将囊泡外的Glu转运进入囊泡,其数量和功能很大程度上决定了突触间隙Glu的水平,进而影响突触传递效能。VGLUTs分为三种亚型,VGLTU1主要分布于与学习记忆功能密切相关的海马、皮层。国外文献和本室前期研究均显示VGLTU1表达与MA神经损伤密切相关,且我们发现选择性VGLUTs抑制剂芝加哥天蓝(chicago sky blue 6B,CSB6B)可以显著抑制MA慢性给药引起的小鼠神经毒性。但是MA对学习记忆功能影响的动态变化,以及VGLUT1在此过程中起着怎样的作用,是损伤的诱导因素还是伴随发生尚不得而知,调控VGLUT1的数量和功能活性能否调节突触间隙异常的Glu浓度(过高或过低),是否就能改善MA对学习记忆功能的损伤也不清楚。本课题的研究思路是:首先在不同动物模型上,观察MA对不同类型学习记忆功能影响的动态变化,同时从病理学角度观察海马、皮层神经元损伤情况以佐证其对学习记忆的损伤。在确定MA对学习记忆有明显损伤的时间点取脑测定VGLUT1表达量,并分析VGLUTs功能抑制剂CSB6B对MA损伤学习记忆功能的影响,试图阐明VGLUT1与MA影响学习记忆功能的相关性。该研究结果将有助于揭示VGLUT1参与MA造成学习记忆功能损伤的机制。实验方法:1.动物学习记忆功能行为学观察:采用小鼠跳台模型观察MA对回避性学习记忆的影响;用Y型迷宫模型和Morris水迷宫模型观察辨识性学习记忆;用条件性位置偏爱(Conditioned place preference,CPP)和行为敏化模型观察对奖赏性学习记忆的影响。采取单次给药及长期给药两种方式。2.组织病理学检测:苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色和尼氏染色。MA处理动物麻醉灌流取全脑,冰冻切片,取海马和皮层切片,进行HE染色和尼氏染色,光学显微镜下观察神经细胞一般病理性变化。Image J软件处理分析海马、皮层部位尼氏小体含量变化。3.透射电镜观察突触结构:MA处理动物麻醉灌流取海马CA1区,制备超薄电镜切片,醋酸铀-硝酸铅双重染色,透射电镜观察,Image J软件处理分析突触界面结构参数。4.VGLUT1 m RNA水平表达的检测:实时定量RT-PCR法。采用Trizol裂解法提取海马、皮层总RNA,以β-actin为内参物,分析VGLUT1 m RNA水平表达的变化。5.VGLUT1蛋白水平表达的检测:蛋白免疫印迹法。提取海马、皮层中的总蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离不同分子量蛋白,将其转移至硝酸纤维素(Nitrocellulose,NC)膜上,结合相应抗体,利用化学发光反应检测目的蛋白。6.采用清醒动物脑微透析结合高效液相-荧光化学检测方法,测定大鼠海马细胞外Glu的含量,观察MA对Glu释放的影响,分析CSB6B对此过程的影响。主要结果:1.MA对动物学习记忆行为的影响:单次、长期(20d)腹腔注射MA可以损伤小鼠回避性记忆及辨识性记忆。长期使用MA的初期(10d)可以促进大鼠辨识性记忆,后期(20-50d)无明显影响。CPP和行为敏化模型上MA可以使小鼠产生非常显著的奖赏性记忆。表明MA对不同类型学习记忆的影响并不一致,损害程度有剂量和时间相关性。单次给予MA,剂量越大对学习记忆的影响越明显;多次给予MA,对学习记忆的影响呈双向反应。与临床观察到的因吸食MA造成兴奋、认知障碍等症状基本相似。2.MA对海马神经元的损伤:HE染色结果显示,MA单次给药及长期(20d)给药可使细胞发生病理性改变。尼氏染色结果显示,MA单次给药及长期(20d)给药后,可导致海马、皮层神经元中尼氏小体显著减少,表明MA致学习记忆损伤的过程中神经元出现损伤现象。3.MA对突触小体的影响:透射电镜结果显示,MA长期(20d)给药后,MA组与NS组相比,海马CA1区神经元突触数目减少,突触间隙距离变宽,突触后致密物减少,活性区长度缩短,突触曲率减小。突触结构的这些改变提示MA可降低海马CA1区神经元突触传递效能,为行为学改变提供物质基础。4.MA对VGLUT1表达量的影响:MA单次给药后第5天小鼠海马、皮层VGLUT1蛋白和m RNA表达降低,第15天与NS组无差异。MA长期(20d)给药结束后第5天小鼠海马、皮层VGLUT1蛋白和m RNA表达升高,持续到第15天。MA连续给药初期(10d),大鼠海马VGLUT1 m RNA表达降低,皮层VGLUT1 m RNA表达升高;连续给药后期(50d),大鼠海马、皮层VGLUT1 m RNA表达无明显变化。5.VGLUTs抑制剂对MA奖赏性记忆的影响:MA可使大鼠产生奖赏性记忆,1.0mg/kg和2.0mg/kg MA可以诱导大鼠形成CPP,脑室给予VGLUTs功能抑制剂CSB6B可防止1.0mg/kg MA诱导的CPP的形成。同时,脑室给予CSB6B可以缓解1.0mg/kg MA诱导的行为敏化现象。表明抑制VGLUT1转运活性,降低突触间隙Glu浓度可对抗MA诱导的成瘾记忆行为。6.MA对Glu释放的影响:清醒动物脑微透析结果显示,MA处理可以增加胞外Glu浓度,给药后2.5h,与基础值相比,Glu浓度可增加至270%。MA使用前2.5h给予CSB6B可以抑制谷氨浓度的增加。表明VGLUT1的活性降低可以抑制MA引起的Glu释放增加。结论:MA对不同类型学习记忆产生的影响不一致,损害程度有剂量和时间相关性。单次给予MA,剂量越大对学习记忆的影响越明显;多次给予MA,对学习记忆的影响呈双向反应。海马、皮层神经元在学习记忆损伤过程中出现损伤现象。伴随MA对学习记忆的损伤,VGLUT1表达量发生显著变化,表明VGLUT1改变与MA影响学习记忆功能密切相关。同时,VGLUTs抑制剂CSB6B可阻碍MA诱导的奖赏性记忆形成以及MA诱导的Glu的释放。以上结果表明,VGLUT1的表达与功能参与了MA对学习记忆的影响。
【关键词】：甲基苯丙胺 学习记忆 囊泡谷氨酸转运体-1 芝加哥天蓝
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.8
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-17
• 第一部分 MA对学习记忆的影响17-46
• 一、实验材料19
• 二、实验方法19-24
• 1. 跳台实验19-20
• 2. Y迷宫实验20
• 3. Morris水迷宫实验20-21
• 4. CPP实验21
• 5. HE染色21-22
• 6. 尼氏染色22-23
• 7. 透射电镜23-24
• 8．统计学处理24
• 三、实验结果24-43
• 1. MA对回避性学习记忆功能的影响24-28
• 2. MA对辨识性学习记忆功能的影响28-37
• 3. MA对奖赏性学习记忆功能的影响37-38
• 4. MA对细胞形态学的影响38-39
• 5. MA对小鼠神经元的影响39-42
• 6. MA对小鼠突触结构的影响42-43
• 四、讨论43-46
• 第二部分MA诱导的学习记忆改变与VGLTU1 的相关性研究46-69
• 一、实验材料48-49
• 二、实验方法49-57
• 1. 实时定量RT-PCR49-51
• 2. 蛋白免疫印迹实验51-53
• 3. CPP实验53
• 4. 行为敏化53-54
• 5. 脑微透析-HPLC实验54-56
• 6. 统计学处理56-57
• 三、实验结果57-66
• （一）MA对VGLUT1 表达的影响57-62
• 1. 产物特异性和完整性分析57-58
• 2. 单次给予MA对小鼠脑内VGLUT1 表达的影响58-59
• 3. 长期给予MA对小鼠脑内VGLUT1 表达的影响59-61
• 4. 长期给予MA对大鼠脑内VGLUT1 mRNA水平表达的影响61-62
• （二）CSB6B对MA诱导行为变化的影响62-65
• 1. CSB6B对MA诱导CPP的影响62-63
• 2. CSB6B对MA诱导行为敏化的影响63-65
• （三）CSB6B对MA引起的Glu释放增加的影响65-66
• 四、讨论66-69
• 结论69-70
• 参考文献70-76
• 个人简历76-77
• 致谢77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 马捷;李峰;郭思媛;宋月晗;刘晶;刘晓萌;;谷氨酸递质调节机制与神经系统疾病[J];现代生物医学进展;2012年27期

2 王欣;刘新民;;甲基苯丙胺对空间学习记忆功能的短期和长期影响[J];皖南医学院学报;2010年06期

  本文关键词：甲基苯丙胺对学习记忆的影响及其与VGLUT-1的相关性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：252521