PCR快速鉴定皮肤癣菌病

发布时间：2017-04-23 22:08

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【摘要】：研究目的 目前实验室常用的皮肤癣菌病的诊断方法为镜检和培养，该方法对操作人员的专业性要求较高，而且培养耗时较长，在皮肤癣菌病的快速鉴定方面，虽然国内已有相关的分子研究报导，但都难以应用于临床。本研究通过对皮肤癣菌菌株以及临床诊断为皮肤癣菌病患者的皮屑标本进行研究，将PCR方法与传统诊断方法的诊断结果进行统计学对比，探索临床皮肤癣菌病的快速简便特异的新型诊断方法。 研究方法 第一部分使用65株皮肤癣菌临床株以及50株非皮肤癣菌临床株和2例人DNA用于PCR体系的优化及CHS1(Chitin synthase1)引物的评估。采用1步法处理皮肤癣菌及非皮肤癣菌菌株获得菌株DNA，然后用皮肤癣菌特异性引物CHS1(panDerm1:5’G A A G A A G A T T G T C G T T T G C A T C G T C T C3’,panDerm2:5’C T C GAG G T C AAAAG C AC G C C AGAG3’）对获得的DNA产物进行PCR扩增。皮肤癣菌通用引物的敏感性测定：将获得的菌株DNA以及人DNA进行PCR扩增后跑电泳，观察是否出现特定大小的阳性条带。 PCR反应体系的敏感性测定：用超微量分光光度计测量皮肤癣菌菌液的DNA浓度，再将皮肤癣菌菌液的DNA进行10倍连续稀释，获得不同浓度的皮肤癣菌菌液，随后进行PCR扩增，记录特定大小的阳性条带出现时的最小的皮肤癣菌DNA浓度值，PCR重复3次。 第二部分，将临床收集的119例皮屑标本，均匀分成三份，分别进行镜检、培养和PCR鉴定。采用Brillowska-Dabrowsk的2步提取法从临床标本中快速提取皮肤癣菌DNA,对临床标本的DNA产物进行PCR扩增时，为了防止体系中PCR抑制物造成的假阴性结果，设计了IC(Internal control内部对照)，内部对照为大肠杆菌质粒，该质粒可与皮肤癣菌CHS1特异性引物反应，产生510bp的内部对照条带。我们设计并合成了特异性引物，其序列为For:5-G AAGAAGAT T G T C G T T T G C AT C GT C T C AG G G T T T GAT T C T G G C T C AG-3，Rev:5-C T C GAG G T C AAAA G C A C G C C AG A G G TAT TA C C G C G G C G G C T G G-3，该引物能与大肠杆菌DNA反应，，生成510bp片段，该片段被插入大肠杆菌质粒，合成本实验所需的质粒。根据电泳结果判断是否为皮肤癣菌感染，若电泳结果出现366bp的条带，则为皮肤癣菌感染，若未出现此特异性条带且出现了510bp的内部对照条带，则能判断为非皮肤癣菌感染，若未出现此特异性条带且未出现510bp的内部对照条带，则为假阴性结果。最后将临床标本的PCR结果与传统诊断方法进行一致性比较。 结果 第一部分：所有皮肤癣菌菌株经PCR扩增后均出现366bp的阳性条带，非皮肤癣菌菌株及人DNA经PCR扩增后均未出现任何条带。将浓度为600ng/ul的皮肤癣菌DNA浓度经10倍连续稀释后，得到7个浓度的菌液：600ng~6pg经PCR扩增后出现366bp的阳性条带，第8个600fg浓度经PCR扩增后未出现任何条带。 第二部分：在119例临床标本中，PCR与传统诊断方法的一致性检验Kappa值为0.910，P0.01，两种方法在诊断结果方面具有较高的一致性。然而PCR方法在5小时内即可完成从标本处理至结果判读的全过程，且操作简便，判断结果客观。 结论 皮肤癣菌通用引物CHS1具有较高的特异性，可用作检测皮肤癣菌的特异性引物，本实验PCR体系的敏感度较高，为6pg。PCR在临床标本的皮肤癣菌检测方面更加简便快速，可替代现有皮肤癣菌病的传统诊断方法。
【关键词】：PCR 癣菌病 CHS1 传统诊断
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R756
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 英文缩写表10-11
• 前言11-17
• 参考文献14-17
• 第一部分 PCR 体系敏感性及特异性测定17-25
• 实验材料18-19
• 实验菌株及人 DNA18
• 实验所用引物18-19
• 实验所用试剂19
• 实验所用器械19
• 实验方法19-21
• 菌种的复活19-20
• 沙保氏培养基的配置20-21
• 菌株 DNA 的提取21
• PCR 反应21
• 不同 DNA 浓度梯度的稀释液21
• 通用引物特异性测定21
• 实验结果21-23
• 用引物的特异性结果21-22
• PCR 体系的反应敏感性测试22-23
• 讨论23-25
• 第二部分 皮肤癣菌病传统诊断方法与 PCR 方法的对比25-40
• 实验材料26-27
• 临床皮屑标本26
• 实验所用试剂26
• 实验所用引物26-27
• 实验所用器械27
• 实验方法27-29
• 皮屑的收集27
• 皮屑的分配27
• 皮屑的 DNA 提取27-28
• 内部对照(Internal control IC)的构建28-29
• 实验结果29-35
• 皮屑标本的传统诊断方法与 PCR 诊断方法的结果对比29-32
• 传统方法与 PCR 诊断法检出率的对比32
• 皮屑标本的 PCR 检测结果32-33
• 临床标本电泳图33-34
• 统计学分析34-35
• 讨论35-40
• 全文小结40-42
• 参考文献42-45
• 综述45-58
• 参考文献54-58
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况58-59
• 致谢59-60

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 高媛;陈烽烽;邓孝廷;田淑琴;丁莉;;致病真菌PCR检测方法的建立[J];中国畜牧兽医;2010年04期

2 徐建平;Heather Yoell;;甲真菌病概述及其诊断最新进展(英文)[J];实验与检验医学;2012年02期

3 谈燕;陈欢;赵瑾;陈江汉;;一步法快速鉴定皮肤癣菌[J];临床军医杂志;2014年08期

4 杨静;童中胜;万U

本文编号：323099