miR-27a在WM239细胞中的表达及对其生物学特性的影响

发布时间：2017-06-20 16:02

  本文关键词：miR-27a在WM239细胞中的表达及对其生物学特性的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的本研究主要通过构建miR-27a模拟物和抑制物,观察miR-27a对黑色素瘤WM239细胞增殖和耐药的影响,并初步探讨其机制。方法将mi R-27a模拟物、抑制物及其阴性对照转染WM239细胞:荧光显微镜观察转染效率,实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测miRNA-27a的相对表达水平,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测WM239细胞增殖,平板克隆试验检测细胞克隆能力,流式细胞仪检测WM239细胞凋亡和细胞周期,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测抑癌基因p53、细胞周期基因cyclin D1、耐药基因MDR1、侵袭转移相关基因MMP2及MMP9、mi R-27a靶基因Sp1、ZBTB10及E2F7的表达变化,WB检测增殖相关分子细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)、caspase-3和耐药蛋白P糖蛋白(P-gp)的表达变化。结果细胞转染效率为80%~90%。转染miR-27a模拟物后,细胞内miR-27a表达量明显上升(2-??CT值为26.98±0.01,F=6078713.38,P0.05);转染miR-27a抑制物后,细胞中mi R-27a的表达量下降(2-??CT值为0.96±0.02),差异无统计学意义。转染miR-27a模拟物后,细胞增殖受到明显抑制,与正常对照组相比差异具有统计学意义(F=129.56,P0.05)。miR-27a模拟物组G0-G1期的细胞比例升高(F=30.33,P0.05),S期和G2-M期细胞比例减少(F=14.98,P0.05;F=3.66,P0.05);模拟物组细胞凋亡率与正常对照组相比明显增加(F=530.90,P0.01);而抑制物组对细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡无明显作用,差异无统计学意义。转染miR-27a模拟物后能明显抑制细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达,促进抑癌基因p53表达,并激活凋亡相关分子天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3);通过检测相关信号通路分子的表达变化,发现细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化水平下降。转染miR-27a模拟物后能明显增强WM239细胞对紫杉醇的药物敏感性,增强紫杉醇的对WM239细胞的杀伤作用,这与miR-27a抑制耐药基因MDR1及其蛋白产物P-gp的表达有关。mi R-27a能抑制细胞侵袭转移相关分子MMP2和MMP9的表达。通过RT-PCR检测发现,转染miR-27a模拟物后其靶基因特异性蛋白1(Sp1)表达下降,而锌指和BTB结构域蛋白10(ZBTB10)表达上升,E2F7的表达无明显变化。结论1.mi R-27a能抑制黑色素瘤细胞WM239增殖,诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期于G0-G1期,其机制可能与cyclinD1表达下降、p53表达上调、caspase-3的活化和ERK1/2的磷酸化被抑制相关;2.mi R-27a能抑制侵袭转移相关分子MMP2、MMP9的表达,发挥抑癌作用;3.miR-27a能增加WM239细胞对紫杉醇的药物敏感性,其机制可能与miR-27a通过ZBTB10-Sp间接调节MDR1/P-gp的表达相关。
【关键词】：miR-27a 黑色素瘤 细胞增殖 细胞凋亡 药物耐受性 转移 转染
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 主要符号表13-14
• 第一章 绪论14-16
• 第二章 实验方案设计与研究方法16-26
• 2.1 主要实验材料与实验仪器16-20
• 2.1.1 主要实验材料16-19
• 2.1.2 主要仪器19-20
• 2.2 实验方法20-25
• 2.2.1 细胞转染及转染效率20
• 2.2.2 MTT检测miR-27a对WM239细胞增殖的作用20
• 2.2.3 MTT法检测miR-27a对WM239细胞耐药性的作用20-21
• 2.2.4 流式细胞术检测miR-27a对WM239细胞周期的影响21
• 2.2.5 流式细胞术检测miR-27a对WM239细胞凋亡的影响21
• 2.2.6 平板克隆形成实验检测转染后WM239细胞的增殖能力21
• 2.2.7 mi-R-27a对细胞耐药蛋白P-gp及相关信号通路ERK1/2 的影响21-23
• 2.2.8 RT-PCR检测转染后Sp1、ZBTB10、E2F7、cyclinD1、p53、MDR1、MMP2、MMP9的表达变化23-25
• 2.2.9 实时定量PCR检测转染后miR-27a的表达水平25
• 2.3 统计学处理25-26
• 第三章 结果26-36
• 3.1 细胞转染效率26
• 3.2 实时荧光定量检测转染后miR-27a的表达26-27
• 3.3 miR-27a对WM239细胞增殖的影响27-31
• 3.3.1 MTT法检测转染后WM239细胞增殖27
• 3.3.2 平板克隆形成试验检测转染后WM239细胞增殖能力27-28
• 3.3.3 流式细胞仪检测转染后WM239细胞凋亡28-29
• 3.3.4 流式细胞仪检测转染后WM239细胞周期29-31
• 3.4 WB检测细胞增殖相关蛋白ERK1/2、caspase-3 和耐药蛋白P-gp的变化31-32
• 3.5 RT-PCR检测细胞增殖相关分子p53，细胞周期相关分子cyclinD1，，多药耐药基因MDR1的变化32-33
• 3.6 MTT法检测转染后WM239细胞对药物敏感性的变化33-34
• 3.7 RT-PCR检测转染后侵袭相关分子MMP9、MMP2的变化34
• 3.8 RT-PCR检测转染后miR-27a靶基因Sp1、ZBTB10、E2F7的变化34-36
• 第四章 讨论36-45
• 第五章 结论与展望45-46
• 参考文献46-52
• 综述52-61
• 参考文献57-61
• 攻读学位期间取得的研究成果61-62
• 致谢62

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  本文关键词：miR-27a在WM239细胞中的表达及对其生物学特性的影响，由笔耕文化传播整理发布。

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