白色念珠菌菌丝壁蛋白1的N端片段的克隆及原核表达

发布时间：2017-06-19 08:00

  本文关键词：白色念珠菌菌丝壁蛋白1的N端片段的克隆及原核表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 随着糖皮质激素、免疫抑制剂和广谱抗菌药物、介入性治疗等诊疗技术的广泛应用，以及艾滋病患者的增加，真菌感染的发病率日趋升高。调查显示侵袭性白色念珠菌病占所有深部真菌感染的比例一直高达70%-85%。尽管有抗真菌药物的治疗，但由于早期诊断困难，侵袭性白色念珠菌病往往预后极差。白色念珠菌是一种既能以酵母形态又能以菌丝形态生长的真菌，产生菌丝是其具有致病力的一种表现，Staab等首先发现白色念珠菌菌丝壁蛋白1（hyphal wall protein1, Hwp1），研究显示，Hwp1具有菌丝特异性及抗原性和种属特异性特点，使其在侵袭性念珠菌病诊断中可能发挥重要作用。本研究拟构建白色念珠菌的菌丝壁蛋白1(Hwp1) N端片段的重组质粒，在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白。为后续探讨Hwp1抗原、抗体系统在诊断侵袭性白念珠菌的作用和地位奠定基础。 方法 1.目的基因的制备：使用酵母基因组提取试剂盒白色念珠菌基因组DNA，经PCR方法扩增获得目的基因。 2.目的基因的克隆：将目的基因克隆至pMD18-T载体上，通过蓝白筛选法获得克隆成功的质粒，经PCR法及双酶切法鉴定目的基因后测序进行检验。 3.重组Hwp1的N端片段的诱导表达：将目的基因连接至表达载体pET28a(+)，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，提取质粒进行PCR、双酶切法鉴定，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导、超声裂解菌体、SDS-PAGE电泳观察结果，获得重组表达的目的蛋白。 结果 1.经PCR方法克隆出全长为500bp的Hwp1基因的N端的核苷酸序列与GenBank中公布的序列基本同源。 2.成功制备了重组质粒pMD18-T-Hwp1及pET28a(+)-Hwp1，PCR及双酶切法鉴定结果。 3.构建了含重组质粒pET28a(+)-Hwp1的大肠杆菌工程菌，经IPTG诱导能高效表达目的蛋白。 结论 1.成功构建了白色念珠菌基因Hwp1基因N端序列的原核表达质粒pET28a(+)-Hwp1。 2．Hwp1基因N端序列的原核表达质粒在大肠杆菌BL-21中成功表达融合蛋白，为进一步研究其在诊断白色念珠菌病中的作用奠定了基础。
【关键词】：白色念珠菌 菌丝壁蛋白1 克隆 表达
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R756.6;Q78
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-12
• 材料与方法12-25
• 结果25-28
• 讨论28-31
• 结论31-32
• 参考文献32-35
• 附录35-36
• 个人简历35
• 发表论文35
• 在读期间获荣誉35-36
• 致谢36-37
• 综述37-46
• 参考文献43-46

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