抗人AFP单链抗体的制备和鉴定

发布时间：2024-04-10 00:43

　　目的：筛选能分泌抗人AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并以其为原料构建抗人AFP单链抗体(ScFv)基因，并将基因转入大肠杆菌表达，分离纯化抗人AFP ScFv抗体，并鉴定其活性。方法：利用GENEDOC软件对人AFP及HSA氨基酸序列进行同源比较。用ELISA及斑点印迹方法从已有的杂交瘤细胞株中筛选与人血清白蛋白无交叉反应的杂交瘤细胞株，根据小鼠IgG V区骨架区保守序列合成通用引物，扩增VH上游引物5端和扩增VL下游引物5`端加入限制性内切酶位点，扩增VH下游引物5端和扩增VL上游引物5`端加入连接肽碱基序列，两者有18个碱基互补。用RNA提取试剂和提取杂交瘤细胞总RNA，用RT-PCR方法，分别分离纯化VH和VL基因片段。用重叠延伸PCR方法将VH和VL连接在一起，构建ScFv基因。将ScFv基因克隆至pGEM-T载体，构建重组pGEM-A质粒并转化大肠杆菌DH5α，通过蓝白筛选阳性菌落，提取质粒，通过限制性内切酶切、PCR和测序鉴定。用限制性内切酶双酶切pGEM-A和大肠杆菌TrxA融合蛋白表达pET32(a+)质粒载体，将从pGEM-A质粒上酶切获得的ScFv基因克连接到pET...

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【学位级别】：博士

【部分图文】：

图1一3斑点印迹实验结果

2特异性鉴定:3.2.1双向琼脂扩散实验结果见图1一2。、、月尹8气l一]尸、S.。石O2O4lP、洲r二一︸A矛rt、3，2:牛血清白蛋白3，5:4:人血清白蛋白6:羊抗鼠IgG一HRP标记，2:BSA3，5:抗体7:兔抗牛血清白蛋白抗体AFP4:HSA6:sheePanti一....

图2一3:RT一PCR扩增的VH和VL基因

结果3.1RNA提取结果图2一2从4H5DI细胞中提取的总RNAFigZ一2ThetotalRNAof4H5DIeellline提取RNA有三条带明显，285，185和5s，RNA无降解。3.2RT一PCR扩增VH和VL结果2000bP1000bP750bP500bP250bP1....

图2一4VH和VL连接后的ScFv基因FigZ一4:TheScFvgenethatlegatedbySOEPCR

100bPA，B:PCRC，D:EeoRI+XhoIM:DL2000Marker图2一5酶切和PCR鉴定结果FigZ一5TheresultofdoubleendonueleasesdigestedandPCRPcR和酶切均获得了750bP左右大小的条带，说明ScFv基因成功克隆入....

图2一5酶切和PCR鉴定结果

100bPA，B:SeFvgeneM:DL2000Marker图2一4VH和VL连接后的ScFv基因FigZ一4:TheScFvgenethatlegatedbySOEPCR经sOE一pCR拼接后，获得的seFv抗体基因大约75obp左右。3.4酶切及PCR鉴定结果1000bP7....

本文编号：3949882