用PCR定点突变方法研究人抗菌肽FALL-39结构与功能的关系

发布时间：2024-04-15 02:47

　　目的：构建人抗菌肽FALL-39的原核表达系统，解决抗菌肽获取困难的难题；用PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体，并比较研究FALL-39及其突变肽的功能。方法：应用RT-PCR从人肺腺上皮细胞株SPC-A-1总RNA中扩增FALL-39成熟肽cDNA，以pGEX-1λT为载体，构建抗菌肽FALL-39基因大肠杆菌表达载体；采用一步法和两步法PCR体外定点突变技术，用赖氨酸替代第24位的谷氨酰胺和／或第32位的天门冬氨酸，构建FALL-39突变体大肠杆菌表达载体；该载体表达的融合蛋白经亲合层析、凝血酶酶切、胶回收和高效液相色谱分离纯化，获得高度纯化的重组FALL-39以及突变肽；对纯化产物进行的MEC、MIC、MBC和溶血性实验等比较抗菌作用以及对红细胞膜的溶解性，用RT-PCR测定人单核巨噬细胞株THP-1 iNOS的表达，研究FALL-39及其突变肽的抗内毒作用。结果：重组质粒pGEX-1λT-FALL-39测序结果说明其插入片段序列与GenBank登录的FALL-39基因的cDNA序列相符，且插入方向正确；DNA测序结果表明在预期位点发生突变，用一步法得到突变体质...

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【学位级别】：博士

【部分图文】：

图1一1SPC一A一1细胞总RNA电泳图

2.1总RNA的提取提取细胞的总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测有两个明显条带(285和185)，基本无降解，无DNA残留和蛋白质污染(图1一1)。2·2RT-PCR扩增结果以提取的RNA为模板用设计的特异引物进行Rl’-PCR扩增，所获得的扩增产物经1.5%琼脂糖电泳检查为一条约14....

图3一5LL3，及其突变蛋白AU一以GE电泳图

2.2FALL一39及其突变体活性蛋白的纯化凝血酶酶切融合蛋白混合溶液用AU一队GE加以分离，可从融合蛋白中分离出FALL一39及其突变的阳离子肤(图3一5)。L「24L「32L「24，32，.心“-图3一5FALL3，及其突变蛋白AU一以GE电泳图Fig.3一5AU一PAGEo....

图3一7HPLC纯化的FALL-39及其突变肤Trieine-SDS-PAGE.一

由于突变肤所携带阳离子电荷多(见表3一l)，因此在AU一PAGE电泳中电泳速度较FALL一39快，其中FALL一39一Lys24’32的电泳速度最快(图3一5)。应用OMIGA蛋白分析软件分析队LL一39及其突变肤，显示FALL一39基本为一线性结构，突变后亲疏水性、Q螺旋结构等....

图4一6FALL39及其突变肤对LPS介导的THP.liNOSmRNA表达的影响

uo﹃的的.﹄dx国」…L图4一7FALL一39及其突变肤对LPS介导的THP一liNOSmRNA表达的影响Fig·4一7InhibitoryeffeetofFALL39anditsmutantPeptidesonLpS一mediatediNOSmRNAexPressioninT....

本文编号：3955616