新型自组装多肽支架对小鼠MSCs的粘附、增殖及成骨效应的体外研究

发布时间：2017-04-08 09:18

  本文关键词：新型自组装多肽支架对小鼠MSCs的粘附、增殖及成骨效应的体外研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：骨移植是一种临床上常用的修复骨缺损的方法。自体骨移植虽然是修复骨大段缺损的金标准,但受到供体骨来源不足、造成新的骨缺损和疼痛等缺点的限制。骨组织工程的迅速发展,为骨缺损的修复带来了新的选择。目前,骨组织工程三要素之一的支架材料成为研究的热点。多种支架材料的出现为修复骨缺损提供了更多的选择,但在研究中也发现这些支架材料尚有很多不足:同种异体骨具有天然骨组织结构,但可能引发免疫反应、传播疾病;人工合成修复材料可大量生产,但存在材料表面亲水性差,细胞不易粘附,缺乏成骨诱导性能等缺点。自组装多肽由人工合成,成分是氨基酸,在水中溶解时自发组装成纳米纤维并相互搭载形成网状结构。纤维直径10~20nm,孔径5~200nm,含水量超过99%。向自组装肽溶液中加入盐离子可以使其迅速形成水凝胶。这种水凝胶支架的优势有:1、水凝胶有着与细胞外基质类似的微环境,利于细胞的粘附、增殖及分化;2、成分明确,降解产物是短肽或者氨基酸,生物相容性较好;3、有一定的可塑性。RADA16-Ⅰ是经典的自组装多肽,序列是Ac N-RADARADARADARADA-CONH2,已有多篇细胞附着生长的文献报道。最近,多名学者用不同的功能基序修饰RADA16-Ⅰ,研究发现这些新型功能化自组装多肽构建的水凝胶支架对细胞的粘附、增殖和分化有良好的促进作用。Ⅰ型胶原来源的DGEA(Asp-Gly-Glu-Ala)序列能够作用于α2β1整合素受体,对细胞粘附有促进作用。基于以上基础,我们将DGEA基序用固相合成法同RADA16-Ⅰ的C端结合,得到新的功能化自组装多肽RAD-DGEA,序列是Ac N-RADARADARADARADA-GG-DGEA-CONH2,但在观察其微观结构时发现它只能形成短的纤维并且相互之间不搭载。将RADA/DGEA与RADA16-Ⅰ等比混合配制成DGEAmx,发现DGEAmx可以形成与RADA16-Ⅰ类似的纤维网状结构。我们将C57小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在空白玻片、RADA16-Ⅰ水凝胶和DGEAmx水凝胶这3组材料上进行培养,并检测细胞的粘附、增殖和分化情况,以期得到一种理想的骨修复支架材料。目的:⑴观察自组装多肽的微观结构;⑵检测细胞在材料上的粘附率;⑶检测细胞在材料上的增殖情况;⑷检测成骨细胞分化指标碱性磷酸酶(alp)活性、细胞间粘附分子-1(icam-Ⅰ)、骨钙蛋白(ocn)的表达以评价成骨效果。方法:⑴原子力显微镜观察(afm)自组装多肽的微观结构:将自组装多肽配制成肽溶液,稀释后将多肽溶液滴加在新剥离开的云母片表面,待干燥后在原子力显微镜下观察多肽的微观结构。⑵镜下细胞计数法检测细胞在材料上的粘附率:在24孔板内放置无菌盖玻片并将自组装多肽溶液滴加在玻片上,加入培养基使其成胶。将小鼠mscs悬液加入培养孔。在加入细胞悬液后的10、30、60、90min时分别对各组材料上粘附的细胞拍照并随机选取3个视野进行计数。⑶cck-8法对比细胞在材料上的增殖情况:细胞培养在各组材料表面,在培养的第1、3、5、7天用cck-8试剂盒检测细胞的增殖。⑷细胞骨架检测:在成骨诱导培养的第3、7、14天时用鬼笔环肽和dapi为细胞骨架和细胞核染色,激光共聚焦镜下观察并拍照。⑸检测成骨细胞分化指标碱性磷酸酶活性、细胞间粘附分子-1、骨钙蛋白的表达以评价成骨效果:将细胞在各组材料上成骨诱导培养,在培养的第3、7、14天时用碱性磷酸酶活性检测试剂盒检测alp活性,real-timepcr检测细胞间粘附分子-1和骨钙蛋白。结果:⑴dgea肽不能形成纤维结构;rada16-Ⅰ可以形成均匀的长纤维结构并相互搭载成网状;rad-dgea只能形成短的纤维结构,但当rad-dgea与rada16-Ⅰ等比混合配制成的dgeamx可以形成类似于rada16-Ⅰ的纤维网状结构。根据afm结果,将后续实验材料分为3组:空白玻片组,rada16-Ⅰ组,dgeamx组。⑵3组材料在不同时间点粘附细胞数经过统计学处理,在第10min时,各组间没有显著性差异(p0.05);而在第30、60、90min时各组粘附细胞数之间分别有显著性差异(p0.05)。⑶细胞在3组不同材料上的增殖情况,经统计学处理,在培养1天时,各组之间没有显著性差异(P0.05);在培养3天时,DGEAmx组高于空白组(P0.05);在培养5天时,各组间分别有显著性差异(P0.05);在培养7天时,DGEAmx组高于其他两组(P0.05)。⑷共聚焦显微镜下观察,在不同时间点相同倍数下DGEAmx组有更高的细胞数量,并且细胞铺展完全,可以观察到粗大的细胞骨架。⑸在成骨诱导培养的3、7、14天时,比较3组材料上的细胞ALP活性,3组之间分别有显著性差异(P0.05);比较3组材料上ICAM-Ⅰ和OCN的表达,DGEAmx组均高于其他两组(P0.05)。结论:支架材料作为骨组织工程的三要素之一,在性能方面有着诸多要求。自组装多肽作为一种人工合成的材料,拥有能够批量生产的优势。其形成的水凝胶有着类似于天然的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的结构,具有较高的含水量和孔隙度,是适合细胞附着和生长的载体。其合成材料是氨基酸,降解产物无毒性,能避免炎症和免疫反应。本研究用固相合成法将功能基序DGEA加入RADA16-Ⅰ并构建了DGEAmx水凝胶,观察了自组装多肽的微观结构并对细胞在多肽水凝胶表面的粘附、增殖和分化进行了检测,结果表明DGEAmx水凝胶是适合细胞体外培养的新型支架材料,作为骨组织工程修复材料有着较好的应用前景。
【关键词】：骨组织工程 自助装多肽 水凝胶 骨髓间充质干细胞 纳米纤维
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定15-25
• 2.1 引言15-16
• 2.2 实验材料16-17
• 2.3 实验方法17-20
• 2.4 实验结果20-23
• 2.5 讨论23-25
• 第三章 功能化自组装多肽水凝胶支架的构建25-32
• 3.1 引言25-26
• 3.2 实验材料26
• 3.3 实验方法26-27
• 3.4 实验结果27-29
• 3.5 讨论29-32
• 第四章 功能化自组装多肽水凝胶支架对小鼠MSCs粘附、增殖及成骨分化的影响32-45
• 4.1 引言32-33
• 4.2 实验材料33-35
• 4.3 实验方法35-39
• 4.4 实验结果39-43
• 4.5 讨论43-45
• 全文总结45-46
• 参考文献46-50
• 文献综述 自组装多肽水凝胶支架在骨组织工程中的应用50-57
• 参考文献54-57
• 攻读硕士学位期间的研究成果57-58
• 致谢58

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本文编号：292560