碳离子硅橡胶改性材料的表面性能及其细胞相容性评价

发布时间：2017-04-26 14:07

本文关键词：碳离子硅橡胶改性材料的表面性能及其细胞相容性评价，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的在整形外科领域，主要依靠植入软组织填充材料来修复体表组织器官的畸形或缺损。硅橡胶（Silicone rubber，SR）因其具有良好的理化稳定性及加工性能，目前仍是临床上最常用的软组织填充材料。但SR材料表面呈现强烈的疏水性，使其与人体组织亲和力较差，可导致一系列临床副反应。因此，选择合适的改性处理方式对硅橡胶材料进行改性，不仅可以提高其临床治疗效果，而且对于研究细胞生物学行为与材料学特性之间的关系都有着意义。据文献报道，在对硅橡胶进行表面改性的研究方法中，有接枝共聚、仿生涂层等方法，但因均存在一些问题，限制了硅橡胶的表面改性效果。如：接枝共聚法，是通过化学反应在聚合物活化的基础上引入特定化学基团，整个过程不仅步骤繁琐，而且形成的化学基团不稳定等因素影响了其改性效果；仿生涂层法，是通过喷涂、溅射等方法，在保持材料本身特性的基础上，覆上一层生物活性物质在材料表面，这种改性方法也存在步骤较为繁琐、难控制操作条件等问题，限制了它的推广应用。于是，我们在前期工作基础上，尝试将离子注入技术用于有机高分子材料表面改性。离子注入技术以往多用于金属与合金材料的改性，它可选择不同的离子源进行注入改性，在改性材料表面形成微图形结构，使材料表面微观结构发生改变，但并不影响基体材料本身的性质，对于硅橡胶的表面改性具有较好的可行性。于是，在本研究中，我们采用了人体的组成性元素碳（C）对硅橡胶表面进行注入处理，得到碳-硅橡胶（Carbon ion implanted silicone rubber，C-SR）。对改性后的材料采用扫描电镜（Scanning electron microscope, SEM）、原子力显微镜（Atomic Force Microscope,AFM）、傅立叶红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）观察材料表面的微观形貌情况；通过X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）、X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）等技术检测分析了改性材料表面的物理化学性能状态；同时采取了一系列试验对改性材料的细胞相容性进行了分析和评价。以期能制备出一种符合临床需要，且副反应较少的新型软组织填充材料。研究方法本研究分为四部分：第一部分：SR和碳-硅橡胶（C-SR）材料的制备及微观形貌观察 1.选用室温硫化双组份医用液态硅橡胶制备普通硅橡胶，室温固化完全后选择表面平整光滑、无缺损、无明显杂质的材料，选择三种离子注入剂量（1015ions/cm2，3×1015ions/cm2，1016ions/cm2）对SR材料表面进行离子注入，分别得到三种碳-硅橡胶改性材料（C-SR1、C-SR2及C-SR3）。 2.通过扫描电镜（Scanning electron microscope, SEM）、原子力显微镜（AtomicForce Microscope, AFM）对改性材料表面的微观形貌进行观察比较。第二部分：SR及C-SR的表面理化性能检测采用傅立叶红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）、X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy, XPS）、X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）等技术及水接触角分析检测并评价纯SR、C-SR1、C-SR2及C-SR3材料表面的理化性能，并采用SPSS20.0进行相关的统计学处理。第三部分：材料的细胞相容性评价 1.细胞准备：应用体外培养法培养人真皮成纤维细胞，并将细胞接种于各材料表面培养，进行后续实验。 2.实验分组情况为： 1）空白组：普通空白培养板中培养生长的人真皮成纤维细胞； 2）SR组：SR材料表面培养生长的人真皮成纤维细胞； 3）C-SR1组：C-SR1材料表面培养生长的人真皮成纤维细胞； 4）C-SR2组：C-SR2材料表面培养生长的人真皮成纤维细胞； 5）C-SR3组：C-SR3材料表面培养生长的人真皮成纤维细胞。 3.通过激光共聚焦观察各组改性材料表面细胞内细胞骨架蛋白(actin)荧光表达情况，并采用CCK-8法检测人真皮成纤维细胞在各组材料表面的增殖情况，对各组改性材料进行生物安全性评价。 4.分别运用免疫荧光技术、Real-time PCR和Western blot技术检测分析材料表面培养的人真皮成纤维细胞中细胞粘附相关蛋白OPN、Vinculin、Zyin及Talin的表达情况，对各组改性材料进行生物功能性评价。第四部分：材料细胞相容性提高的机制研究 1.采用免疫荧光染色检测了在加入外源性OPN单克隆抗体或外源性重组OPN蛋白情况下，细胞骨架蛋白(actin)的表达情况，同时比较了各组材料表面细胞生长状态及细胞粘附的差异。 2.采用Western Blot技术检测了材料表面细胞外培养上清中有无OPN的表达及其表达有无差异。 3.采用Trans-well趋化试验检测了OPN与MMP9是否能促进细胞迁移，并通过明胶酶谱法检测了各组材料表面细胞内的MMP9活性高低情况。 4.在成功构建了MMP9-RNAi模型的基础上，通过加入与未加入外源性重组OPN，采用激光共聚焦显微镜观察比较OPN与MMP9的表达变化，并观察细胞的形态、增殖及粘附变化。研究结果 1.成功制备了SR，并采用多功能离子注入机在预先设定的条件下成功制备了三种不同离子注入条件的C-SR改性材料。 2.使用SEM观察C-SR改性材料与SR比较，微观形貌无明显差异。进一步用AFM观察得到，SR表面呈光滑样，稍有不平；碳离子注入后，C-SR材料表面呈现丘陵样地形，“突起”分布随离子注入剂量的增加而增多，但分布较为均匀。 3. FTIR结果显示，C-SR各组改性材料与SR比较无明显变化，提示C-SR并未改变SR的有机官能团构成；C-SR的XRD图谱较SR有所改变，形成了新的峰，提示C离子的注入在SR表面形成了新的晶体结构，但差异并不显著；XPS分析显示经过了碳离子注入的C-SR其Si、C、O三种原子的峰均发生了变化，其中C原子的百分比随离子注入剂量的增高峰值越高，Si原子的百分比随离子注入剂量的增高峰值越低，说明碳离子注入后取代了部分Si原子，改变了材料的表面化学成分；通过水接触角分析得到，C-SR的水接触角较SR明显降低，说明碳离子注入可以改善SR材料表面的疏水性。 4.采用激光共聚焦显微镜观察各组材料表面培养的细胞内骨架蛋白（actin）的表达情况得出，C-SR表面培养的细胞内actin的荧光表达量明显较SR强烈，且随着改性材料C离子注入剂量的增多，其表达量越高。 5. CCK-8法检测材料表面细胞的增殖情况，结果显示，C-SR表面培养的细胞较SR具有更好的细胞增殖能力，且随着离子注入剂量的增加，其细胞增殖情况越好。 6.对各组材料表面培养的细胞内细胞粘附相关蛋白（OPN、Vinculin、Talin、Zyxin）等进行免疫荧光染色及Western Blot检测结果显示，C-SR材料表面细胞表达的粘附相关蛋白（OPN、Vinculin、Talin、Zyxin）均优于SR，并随着碳离子注入剂量的增加，蛋白表达量越高。 7. Real-time PCR检测结果显示：与SR组相比，C-SR1组、C-SR2组和C-SR3组的细胞中Vinculin-mRNA、OPN-mRNA表达明显增高（P0.05），且在C-SR三组中比较，随着离子注入剂量的增加，Vinculin mRNA、OPN mRNA表达呈现递增趋势。 8.在对OPN的作用研究中，我们加入外源性OPN单克隆抗体后，可观察各组材料细胞内骨架蛋白的表达水平均有所下降，且细胞的形态、粘附情况也受到影响，而在加入外源性重组OPN蛋白后可逆转这一现象。 9.采用Western Blot检测到各组材料表面细胞外均有OPN的分泌，OPN可能在细胞外起桥梁蛋白作用，能够调节相关蛋白酶的表达，从而促进细胞的粘附、增殖与迁移。 10.采用Trans-well趋化试验检测了OPN与MMP9的迁移能力，观察到OPN与MMP9均具有促进细胞迁移的作用；进一步在明胶酶谱试验中得到在C-SR材料上MMP9活性明显高于SR。 11.成功构建了MMP9-RNAi模型，并在此基础上比较了加入与未加入外源性重组OPN蛋白情况下，观察到未加入外源性重组OPN蛋白时，MMP9与OPN的表达水平均有所下降，细胞的粘附、生长状态、增殖情况也较差，在加入了外源性重组OPN后，上述情况明显有所改善。表明，外源性OPN能上调MMP9表达，两者共同参与了改性材料细胞相容性的提高。结论： 1. C-SR改性材料制作方法较为简便，具有可加工性，可行性较好。 2. C-SR改性材料表面理化性能稳定，既保持了SR的优良特性，又改善了SR的疏水性能，使其具有更好的组织亲和力。 3. C-SR改性材料表面培养的人真皮成纤维细胞生长状态、增殖能力、细胞粘附能力均优于SR，说明C-SR较SR具有更好的细胞相容性，更适合用于临床的长期植入以修复机体部位的缺损。 4.在对C-SR细胞相容性得到提高的机制研究中，我们认为材料表面的理化性能发生改变后，影响了材料表面的微环境，进而选择性地增强了OPN及其他蛋白的吸附，而OPN通过与其受体发生特异性结合后介导了相关的信号转导，上调了MMP9的表达，引起相应的细胞应答，进而提高了材料的细胞相容性。
【关键词】：硅橡胶 离子注入 理化性质 细胞粘附 细胞相容性 骨桥蛋白
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08
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