利用重组人源胶原蛋白制备生物医学组织工程材料

发布时间：2017-04-27 02:01

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【摘要】：本论文以基因工程菌Pichia pastoris高密度发酵获得的重组人源胶原蛋白(Recombinant Human-source Collagen, RHSC)为主要研究对象,对其进行分离纯化和结构表征,并与壳聚糖复合,通过冷冻干燥技术制备三维多孔状海绵支架。选择具有强抗氧化活性的原花青素(Proanthocyanidins, PA)作为交联剂,以期提高支架的各方面特性。1.通过分离纯化获得的RHSC达到电泳纯,测试显示：纯度99%,回收率93%。采用DSC,紫外光谱,红外光谱和NMR对RHSC进行结构表征,并与标准Ⅲ型胶原蛋白比对,确定RHSC具有Ⅲ型胶原蛋白的特征结构。2.通过改变壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵基质制备过程中的因素发现,醋酸的浓度和壳聚糖与RHSC的质量比是影响微观结构形成的关键因素。通过PA交联作用制备的海绵成品具有良好的理化性质,其内部孔径约为110-160μm,孔隙率92%,吸水率约为3900%；红外光谱测试发现,PA与海绵基质可以形成稳定的氢键；DSC和TG分析显示：通过交联作用,海绵的热稳定性提高；体外酶解实验表明,交联后海绵的抗酶解能力增强。对海绵进行生物相容性研究,内容包括细胞的黏附、迁移、增殖和细胞形态等方面,结果显示：海绵支架具有较好的细胞相容性。PA交联的壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵是一种理化性质良好的生物材料,对细胞的黏附、生长和增殖都有一定的促进作用,尽管目前还处于实验研究阶段,但有望进一步应用于组织工程化器官的研究以及临床的应用。
【关键词】：重组人源胶原蛋白 壳聚糖 原花青素 组织工程 生物相容性
【学位授予单位】：南京理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ93;R318.08
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 1 绪论10-26
• 1.1 组织工程10-14
• 1.1.1 组织工程的发展史11
• 1.1.2 组织工程的定义11-12
• 1.1.3 组织工程的原理和方法12
• 1.1.4 组织工程支架材料12-14
• 1.2 细胞外基质14-15
• 1.2.1 细胞外基质主要成分14
• 1.2.2 细胞外基质的作用14-15
• 1.2.3 组织工程支架材料与细胞外基质15
• 1.3 胶原蛋白15-21
• 1.3.1 胶原蛋白的概述15-16
• 1.3.2 胶原蛋白的结构16-17
• 1.3.3 胶原蛋白的分类17-19
• 1.3.4 胶原蛋白材料在组织工程中的应用19-20
• 1.3.5 重组人源胶原蛋白20-21
• 1.4 壳聚糖21-22
• 1.5 胶原蛋白与壳聚糖22-23
• 1.6 交联剂23-24
• 1.7 本实验的研究内容与意义24-26
• 2 重组人源胶原蛋白的分离纯化与结构表征26-35
• 2.1 实验材料与方法26-29
• 2.1.1 菌种与主要实验试剂26
• 2.1.2 主要仪器26-27
• 2.1.3 重组人源胶原蛋白的获得27-28
• 2.1.4 分析方法28
• 2.1.5 RHSC的微观形貌观察28
• 2.1.6 重组人源胶原蛋白的结构表征28-29
• 2.2 结果与讨论29-34
• 2.2.1 RHSC纯化结果29-30
• 2.2.2 RHSC结构表征30-34
• 2.3 本章小结34-35
• 3 壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵基质微观结构的调控35-43
• 3.1 实验材料与方法35-37
• 3.1.1 主要实验试剂35
• 3.1.2 主要仪器35-36
• 3.1.3 分析方法36
• 3.1.4 壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵基质微观结构的调控36-37
• 3.2 结果与讨论37-42
• 3.2.1 不同醋酸浓度对壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵基质微观结构的影响37-38
• 3.2.2 不同重组人源胶原蛋白与壳聚糖质量比对海绵基质微观结构的影响38-40
• 3.2.3 不同冷冻温度对壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵基质微观结构的影响40-41
• 3.2.4 不同预冻时间对壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵基质微观结构的影响41-42
• 3.3 本章小结42-43
• 4 PA交联的壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵理化性质研究43-54
• 4.1 材料与方法43-46
• 4.1.1 主要材料43
• 4.1.2 仪器设备43-44
• 4.1.3 壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵的制备44
• 4.1.4 壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵外观形貌44-45
• 4.1.5 PA交联海绵的红外分析45
• 4.1.6 DSC和TG分析45
• 4.1.7 吸水率测试45
• 4.1.8 孔隙率测试45
• 4.1.9 体外酶解实验45-46
• 4.2 结果与讨论46-53
• 4.2.1 壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵的形貌46-48
• 4.2.2 PA交联壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵红外分析48-49
• 4.2.3 热学分析49-51
• 4.2.4 壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵成品的吸水率测试51-52
• 4.2.5 壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵成品的孔隙率52
• 4.2.6 壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵的酶解实验52-53
• 4.3 本章小结53-54
• 5 壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵的生物相容性54-63
• 5.1 材料与方法54-57
• 5.1.1 材料54-55
• 5.1.2 溶液的配制55
• 5.1.3 仪器设备55
• 5.1.4 壳聚糖-重组人源胶原蛋白海绵浸提液的制备55-56
• 5.1.5 细胞相容性评价实验56-57
• 5.2 结果与讨论57-62
• 5.2.1 黏附实验57-58
• 5.2.2 增殖实验58-59
• 5.2.3 AO/EB荧光染色59-62
• 5.3 本章小结62-63
• 总结63-64
• 展望64-65
• 致谢65-66
• 参考文献66-73
• 附录73

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