hEGF生物活性新型蚕材料的创制与研究

发布时间：2017-04-29 15:01

  本文关键词：hEGF生物活性新型蚕材料的创制与研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蚕丝作为一种纺织材料,因光泽柔和、吸湿保暖性好、易于加工、舒适度好且能通过印染轻松染色等优点在服装纺织行业享有美誉。同时,蚕丝作为一种理想的生物材料,因独特的机械性能、良好的生物相容性、较强的环境稳定性和可缓慢降解等特性,逐渐在医学和生物组织工程领域崭露头角。然而,天然蚕丝仍旧存在染色牢固度差、易脱色、机械性能远不及蜘蛛丝纤维、其医学材料特性依旧满足不了当前医学组织工程研究需要等缺陷。为了改善天然蚕丝存在的上述缺陷,研究人员们建立了基于piggyBac转座子的家蚕丝腺特异启动系统,探索利用转基因家蚕创造具有新型功能蚕丝材料的可行性,例如通过在家蚕丝腺表达荧光蛋白,获得在自然光下即可呈现绿色、红色或橘色的转基因彩色蚕丝；通过在丝腺表达外源蜘蛛丝蛋白或多肽,获得机械性能增强的转基因蚕丝；通过丝腺表达不同医用目的的外源蛋白和多肽,获得细胞粘连性、生物相容性或钙离子吸附能力提高的具有特定新功能的转基因医学蚕丝材料。但是,利用上述方法获得的蚕丝材料仍有不足,转基因彩色蚕丝出现了机械性能的下降,转蜘蛛丝基因获得的蚕丝机械性能增强不显著,医用蚕丝材料中表达的目的蛋白不具有生物学活性等。人表皮生长因子(human epidermal growth factor, hEGF)是广泛存在于哺乳动物体内的一类多肽物质,能极强的促进各种表皮细胞的生长,在医学上用于烧烫伤、溃疡、各类创伤以及角膜损伤的治疗。为了探究能否利用家蚕丝腺特异启动系统表达出具有生物学活性的hEGF,从而获得具有hEGF生物学活性的蚕丝材料。我们基于本研究团队2010年获得的丝素重链高效表达载体R3,构建了两个不同丝腺特异表达载体通过转基因拟期创制具有hEGF生物活性新型蚕丝材料。具体研究内容如下：1、两种hEGF-重链融合蛋白转基因表达载体的构建家蚕丝素重链表达载体R3,主要由丝素重链基因N端、C端序列以及中间融合表达的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因构成,在表达载体R3的基础上,我们用hEGF基因将EGFP基因替换,构建了转基因表达载体pBac{Fib-H P3-hEGF-LBS;3×P3-DsRed};在hEGF-重链融合蛋白能够正常加工和分泌的前提下,将信号肽切割位点(Cs)下游的重链N端序列以及参与蛋白分泌的半胱氨酸(Cys)上游的重链C端序列尽数截去,构建了另一个转基因表达载体pBac{Fib-H P3(s)-hEGF-LBS(s); 3×P3-DsRed}。2、hEGF转基因品系的建立和分子鉴定通过家蚕显微注射的方法,将hEGF-重链融合蛋白转基因表达载体和辅助质粒pHA3PIG共同导入家蚕实用品种871非滞育的GO代早期胚胎中,并利用体式荧光显微镜对回交产生的G1代蚕卵胚胎和蚕蛾眼部进行红色荧光的筛选。将载体pBac{Fib-H P3-hEGF-LBS; 3×P3-DsRed}注射获得的转基因系命名为TSL-P;将载体pBac{Fib-HP3(s)-hEGF-LBS(s);3×P3-DsRed}注射获得的转基因系命名为TSL-P(s)。其中TSL-P阳性率为11/60(18.3%),TSL-P(s)阳性率为7/31(22.6%)。通过Southern blotting和Inverse PCR对TSL-P和TSL-P(s)共18个阳性品系个体的外源基因片段插入拷贝数和位置进行统计,其中转基因蚕茧中hEGF纯蛋白含量最高的TSL-P-2和TSL-P(s)-7两个品系都是单拷贝,分别插入在家蚕9号和8号染色体上。3、转基因蚕茧中hEGF-重链融合蛋白的分子检测利用0.6g mL-1 LiSCN溶液溶解蚕茧、离心取上清获得蚕丝蛋白样品,并通过SDS-PAGE和Western blotting对蚕丝蛋白样品进行分析。结果表明：1、hEGF-重链融合蛋白均已在TSL-P和TSL-P(s)转基因家蚕后部丝腺表达并参与蚕茧的形成,并且TSL-P转基因蚕茧中hEGF蛋白含量的平均值(4.9%)远大于TSL-P(s)(2.1%),其中TSL-P-2和TSL-P(s)-7 hEGF纯蛋白的含量最高,分别为16.7%和3.0%；2、hEGF-重链融合蛋白的实际分子质量,TSL-P大于预测值,而TSL-P(s)与预测值大小一致,该结果表明TSL-P转基因系融合蛋白可能存在磷酸化、甲基化等后期加工修饰过程,结合之前研究结果可以推断出后期加工修饰的区域就是位于本研究中被截去的丝素重链C段序列。4、转基因蚕丝中hEGF生物学活性检测利用55℃碱液对转基因蚕丝材料进行脱胶处理,并对脱胶后的蚕丝材料是否具有hEGF生物学活性进行检测。将浸泡过脱胶蚕丝的细胞培养基用于人表皮成纤维细胞的培养,通过Brdu免疫荧光对细胞分裂率进行分析；将相同质量和体积的脱胶茧片铺在人表皮成纤维细胞表面进行共培养,5天后对细胞进行MTT增值分析。两个实验结果一致表明,TSL-P(s)转基因蚕丝中的融合蛋白具有hEGF的生物学活性,可以促进人表皮成纤维细胞的分裂和增殖,而TSL-P转基因系蚕茧中的融合蛋白几乎没有生物学活性。本研究利用家蚕丝素重链表达载体成功在蚕丝中表达了hEGF-重链融合蛋白,获得一种具有hEGF生物学活性的转基因蚕丝材料。该研究结果可以为转基因技术在家蚕新型生物材料创制方面的应用以及转基因蚕丝作为医用材料的前景提供了一定的理论和应用价值。
【关键词】：蚕丝生物材料 人表皮生长因子 丝素重链表达系统 转基因家蚕
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08;Q78
【目录】：

• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 第一章 文献综述14-30
• 1.1 概述14-16
• 1.2 转基因技术的研究进展16-24
• 1.2.1 PiggyBac转座子系统16-18
• 1.2.2 新型基因编辑技术18-24
• 1.3 茧丝素材创新研究进展24-28
• 1.3.1 丝胶融合表达载体的素材创新24-25
• 1.3.2 丝素融合表达载体的素材创新25-28
• 1.4 人类表皮生长因子研究进展28-30
• 第二章 引言30-32
• 2.1 研究背景与意义30
• 2.2 主要研究内容30-31
• 2.3 技术路线31-32
• 第三章 hEGF-重链融合蛋白转基因表达载体的设计和构建32-40
• 3.1 实验材料与试剂32-33
• 3.1.1 实验材料32
• 3.1.2 主要仪器和试剂32-33
• 3.1.3 主要溶液及其配置33
• 3.2 实验方法33-36
• 3.2.1 引物设计33
• 3.2.2 目的片段的克隆33-36
• 3.2.3 转基因表达载体的设计和构建36
• 3.3 结果与分析36-38
• 3.3.1 hEGF基因片段的合成36-37
• 3.3.2 转基因表达载体的构建37-38
• 3.3.3 重链融合蛋白氨基酸序列比较38
• 3.4 小结与讨论38-40
• 第四章 hEGF转基因品系的建立和分子鉴定40-52
• 4.1 实验材料与试剂40-41
• 4.1.1 实验材料40
• 4.1.2 主要仪器和试剂40
• 4.1.3 主要溶液及其配置40-41
• 4.2 实验方法41-47
• 4.2.1 转基因载体的显微注射41-42
• 4.2.2 转基因阳性个体家蚕的筛选与饲养42
• 4.2.3 转基因阳性个体的分子鉴定42-47
• 4.3 结果与分析47-50
• 4.3.1 显微注射及转基因阳性个体的筛选统计47-48
• 4.3.2 外源基因片段插入拷贝数分析48-49
• 4.3.3 外源基因片段插入位点分析49-50
• 4.4 小结与讨论50-52
• 第五章 转基因蚕茧中hEGF-重链融合蛋白的分子检测52-58
• 5.1 实验材料与试剂52-53
• 5.1.1 实验材料52
• 5.1.2 主要仪器和试剂52
• 5.1.3 主要溶液及其配置52-53
• 5.2 实验方法53-54
• 5.2.1 蚕丝总蛋白样品制备53
• 5.2.2 SDS-PAGE蛋白电泳53-54
• 5.2.3 Western blotting检测54
• 5.2.4 hEGF纯蛋白含量计算54
• 5.3 结果与分析54-56
• 5.3.1 hEGF-重链融合蛋白的分子检测54-56
• 5.4 小结与讨论56-58
• 第六章 转基因蚕茧中hEGF-重链融合蛋白生物学活性检测58-64
• 6.1 实验材料与试剂58-59
• 6.1.1 实验材料58
• 6.1.2 主要仪器和试剂58
• 6.1.3 主要溶液及其配置58-59
• 6.2 实验方法59-60
• 6.2.1 脱胶茧丝的制备59
• 6.2.2 脱胶茧片的制备59
• 6.2.3 细胞培养和传代59
• 6.2.4 Brdu免疫荧光分析59-60
• 6.2.5 MTT细胞增殖检测60
• 6.3 实验结果60-63
• 6.3.1 Brdu免疫荧光结果与分析60-62
• 6.3.2 MTT细胞增殖数据统计与分析62-63
• 6.4 小结与讨论63-64
• 第七章 总结64-66
• 参考文献66-76
• 附录76-78
• 在校期间发表的文章及科研情况78-80
• 致谢80-81

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 陈华,朱良均,闵思佳,胡国梁;蚕丝丝胶蛋白的结构、性能及利用[J];功能高分子学报;2001年03期

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本文编号：335074