不同时期离心力对小鼠骨髓间充质干细胞向软骨分化的实验研究

发布时间：2017-05-02 23:13

  本文关键词：不同时期离心力对小鼠骨髓间充质干细胞向软骨分化的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:观察小鼠骨髓间充质干细胞微团培养成软骨分化过程中,不同时期离心力对其的作用,探讨力学因素与Notch信号通路在软骨分化过程中的作用机制。方法:昆明小鼠骨髓间充质干细胞分离,多次换液传代培养至第3代,进行细胞表型鉴定,以1×106细胞量制作成细胞微团。按处理因素的不同将试验分为5组:A组:诱导培养第1周离心处理;B组:诱导培养第2周离心处理;C组:诱导培养第3周离心处理;D组:诱导培养第4周离心处理;E组:静态培养,期间未进行离心处理。实验采用Eppendorf 5920 R恒温离心机提供37℃,200G,2h/d相对离心力,每周换液2次。在相应处理后于第7、14、21、28日采用CCK-8法和PCNA标记法检测离心处理后细胞与对照组细胞的增殖效率,RT-PCR分析Sox9,Col-Ⅱ,及Notch信号通路相关分子表达。Elisa法测定每次换液后各组培养基内Col-Ⅱ的蛋白含量。28天后,番红O染色检测各组ECM,免疫荧光检测各组Col-Ⅱ表达。结果:1.原代细胞呈类圆形,24小时后可见少许贴壁,传代后细胞呈长梭形,生长迅速,细胞集落形成,呈漩涡状生长。流式细胞仪鉴定为CD45阳性表达,CD11b,CD34,CD29阴性表达。细胞纯度高,为间充质干细胞表型。2.细胞增殖率检测:A,B组较对照组细胞增殖明显,C,D组细胞增殖效率与对照组没有显著差异。3.RT-PCR检测:诱导28天后Sox9与Col-Ⅱ表达相一致,B,C组表达较对照组增高,A组较对照组降低,D组无明显差异。Notch1和Hey1表达相一致,B,C组均较对照组降低;A,D组均升高。Hes1表达各组间没有明显差异。A组离心7天后(第1周末)与对照组相比,Sox9与Col-Ⅱ表达均降低(P0.05),Notch1与Hey1表达均增高(P0.05);B组离心7天后(第2周末)与对照组相比,Sox9与Col-Ⅱ表达明显增高(P0.05),Notch1与Hey1表达降低(P0.05);C组离心7天后(第3周末)与对照组相比,Sox9与Col-Ⅱ表达明显增高(P0.05),Notch1与Hey1表达降低(P0.05)。4.培养基中Col-Ⅱ的浓度随着诱导时间呈现增长趋势,与对照组相比,A组分泌Col-Ⅱ受到抑制,分化延迟,且终浓度较低;B组诱导效果最明显,Col-Ⅱ早期分泌,且终浓度最高;C组诱导效果亦显著,终浓度与B组相当;D组诱导效果无差异。5.番红O及免疫荧光染色显示各诱导组均成软骨诱导成功,B组ECM和Col-Ⅱ表达最多,A组细胞密度最大。结论:不同时期离心力对间充质干细胞成软骨分化的作用不同。软骨分化的第二周给予细胞离心力可促进软骨基质形成并促进细胞增殖,是离心力干预最佳时期。早期离心力干预可激活Notch信号通路,从而抑制细胞成软骨分化。分化中期的离心力干预可能通过抑制Notch信号而促进软骨形成。
【关键词】：软骨分化 离心力 Sox9 Notch
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R684;R318.08
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 常用缩写词中英文对照表10-11
• 前言11-13
• 1 材料与方法13-21
• 1.1 一般资料13-14
• 1.2 研究方法14-20
• 1.3 统计学处理20-21
• 2 结果21-28
• 2.1 小鼠间充质干细胞分离及体外扩增21
• 2.2 小鼠BMSCs的鉴定21-22
• 2.3 不同时期离心力对小鼠BMSCs增殖的作用22-23
• 2.4 RT-PCR检测23-25
• 2.5 诱导28天后番红O染色25-26
• 2.6 免疫荧光检测Col-Ⅱ26
• 2.7 Elisa法检测培养基中Col-Ⅱ26-28
• 3 讨论28-31
• 4 结论31-32
• 参考文献32-36
• 综述36-45
• 参考文献41-45
• 致谢45-46
• 在学期间参与的科研课题与研究成果46-47
• 个人简历47

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本文编号：341892