PHBV纳米纤维对大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响

发布时间：2017-05-05 08:06

  本文关键词：PHBV纳米纤维对大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：探究静电纺丝制备的聚羟基丁酸戊酸共聚酯(Poly-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate , PHBV)纳米材料对大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)粘附、增殖以及向神经元样细胞分化的影响,为PHBV纳米材料与骨髓间充质干细胞联合移植治疗脊髓损伤提供新的依据。方法：取4周龄(100-120g)的SD大鼠,将股骨和胫骨分离出,从中提取骨髓,采用贴壁分离培养的方法分离纯化大鼠BMSCs,待细胞融合80%后1：2分瓶传代,传至第3代时,细胞计数后,以2×104/ml接种至静电纺丝制备的PHBV纳米纤维膜(定向A-NF与非定向R-NF)上,以接种至玻片上为对照组,倒置显微镜下观察对照组细胞形态。用电镜观察细胞与PHBV纳米纤维膜的粘附情况,于培养第1、4、7天时,使用细胞计数试剂盒CCK-8检测各组细胞增殖情况。待细胞与PHBV纳米纤维膜融合后,以维甲酸(RA)作为增殖及分化诱导因子,每孔加入200uL对BMSCs进行增殖培养、分化诱导,倒置显微镜下观察对照组细胞生长形态的变化,于第2、4、6天将各组细胞采用4%多聚甲醛固定,封闭,用Nestin,MAP-2, GFAP抗体行化学染色鉴定神经干细胞,神经元和神经胶质细胞的生成情况。结果：BMSCs与PHBV纳米纤维膜有很好的相容性,定向与非定向PHBV纳米纤维膜均能很好的促进细胞增殖,第1天,A-NF与R-NF表面细胞略多于玻片上的细胞,A-NF与玻片上细胞无统计学意义(P0.05), R-NF表面细胞与两者皆有统计学意义(P0.05),第4天及第7天时,A-NF与R-NF表面细胞显著增长,其中R-NF表面细胞增殖显著高于A-NF表面,具有统计学意义(P0.05),且两者与玻片细胞均有统计学意义(P0.05)。在A-NF表面的细胞沿纤维方向生长,其形态被显著拉长。加入维甲酸(RA)诱导剂24h后,细胞形态开始变化,胞体开始回缩,突起逐渐伸出。免疫荧光染色示PHBV纤维膜上的细胞在第2天即可检测到Nestin阳性细胞的表达,第4天可检测到MAP-2, GFAP阳性细胞表达,对照玻片组第4天开始表达Nestin抗体,第6天开始表达MAP-2, GFAP抗体。结论：A-NF和R-NF均能很好的促进细胞增殖,有良好的相容性,且R-NF表面细胞增殖显著高于A-NF表面。定向纳米纤维通过引导细胞骨架延伸从而对细胞形貌产生显著影响,使着细胞沿着纤维方向定向生长,这和神经细胞轴突定向生长相符合。PHBV纳米纤维膜能促进BMSCs向神经元样细胞的分化,缩短分化所需的时间。因此,我们认为定向纳米纤维支架可能在神经组织工程中更有优势。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 PHBV纳米材料 神经元样细胞 定向 非定向 静电纺丝
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R68;R318.08
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 缩略词表9-11
• 前言11-13
• 综述13-21
• 材料与方法21-30
• 一. 实验器材及试剂21-24
• 二. 实验的方法步骤24-29
• 三. 统计学方法29-30
• 实验结果30-38
• 1. 材料的形态学观察30-31
• 2. BMSCS的培养31-32
• 3. BMSCS在PHBV材料上的表面形态32-33
• 4. 倒置显微镜下观察对照组神经元细胞的形态变化33
• 5. 细胞活性的检测33-34
• 6. BMSCS的诱导分化及鉴定34-38
• 讨论38-42
• 1. PHBV纳米纤维膜38-39
• 2. 大鼠间充质干细胞的原代获取与鉴定39
• 3. PHBV与细胞的融合39-42
• 结论42-43
• 论文总结43-46
• 1 论文创新43-44
• 2 论文不足44-45
• 3 展望45-46
• 参考文献46-50
• 致谢50-52
• 作者简介52
• 研究生发表论文52

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