组织工程纤维环-髓核复合组织的构建及评估

发布时间：2017-05-30 16:02

  本文关键词：组织工程纤维环-髓核复合组织的构建及评估，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:1.评估丝素蛋白来源的一体化纤维环-髓核(AF-NP)支架作为组织工程椎间盘支架的可行性。2.探讨取向性聚己内酯(PCL)纤维环支架复合兔AF细胞体外构建组织工程纤维环的可行性。3.探讨以取向PCL/海藻酸钠水凝胶复合兔椎间盘AF细胞和NP细胞裸鼠皮下构建组织工程椎间盘的可行性。方法:1.以丝素蛋白溶液为原料,分别采用石蜡球致孔法和相分离法制备三维多孔一体化AF-NP支架。采用体视显微镜、扫描电镜(SEM)观察支架内部结构,测定双相支架AF相和NP相的孔径、孔隙率及一体化支架压缩弹性模量;分离培养兔AF细胞和NP细胞,接种至双相支架的相应部位,体外培养48 h,SEM、Live/dead、HE染色评价支架与细胞的生物相容性;CCK-8检测细胞的增殖活性。2.以PCL为材料,采用湿纺-成形法制备环形取向微米纤维环支架。采用体式显微镜、SEM、Micro-CT观察支架表面形态、纤维直径,测定支架的孔隙率。分离培养兔AF细胞并接种至PCL支架上,体外培养。通过SEM、Live/dead、鬼笔环肽染色、Di I荧光标记,观察细胞在支架上的活性、形态、黏附、迁移情况,评价支架生物相容性。分别于体外培养1周、3周组织学染色观察,并行MTT检测及蛋白多糖、胶原生化定量分析;RT-PCR检测AF细胞蛋白聚糖及Ⅰ、Ⅱ型胶原基因表达;同时检测其力学性能。3.以PKH26标记的AF细胞接种到取向PCL纤维支架,复合海藻酸钠水凝胶包裹PKH67标记的NP细胞,体外培养1周后,植入裸鼠皮下构建组织工程椎间盘;体内培养8周后,动物活体荧光成像系统检测椎间盘细胞体内荧光分布情况;复合物植入4周、8周后,取材、冰冻切片,观察细胞荧光情况,行组织学染色评估;同时分析其力学性能。结果:1.体视显微镜和SEM见支架AF相和NP相均呈相互连通的多孔结构,孔隙高度连通,交接区域结合紧密;AF相孔径为(220.0±23.1)μm,NP相孔径为(90.0±17.8)μm;孔隙率分别为91%和93%;一体化支架压缩弹性模量为(150.7±6.8)k Pa。SEM和HE染色见细胞均匀地黏附在支架表面,细胞周围有细胞外基质分泌;Live/dead染色显示细胞活性良好;CCK-8增殖分析显示两种细胞均具有良好的增殖活性。2.体式显微镜、SEM、Micro-CT示PCL纤维排列呈平行取向,纤维表面光滑、规则,直径均匀。纤维直径(16.13±2.77)μm,孔隙率(69.33±6.67)%。SEM见细胞长梭形粘附在支架上;Live/dead染色示细胞活性良好;鬼笔环肽染色示细胞肌丝沿PCL纤维取向性伸展;Di I荧光标记示细胞迁移渗透到支架内部;组织学染色显示细胞及细胞外基质均沿微米纤维取向性分布,且21天染色阳性强度较7天增强;MTT分析,蛋白多糖、Ⅰ、Ⅱ型胶原生化定量检测显示细胞增殖明显,细胞外基质分泌逐渐增加(P0.05);RT-PCR显示细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因表达逐渐增加(P0.05)。压缩模量和拉伸模量均随培养时间增加而逐渐增加。3.组织工程化椎间盘大体观察见圆盘状类椎间盘样组织;活体荧光成像系统显示在AF相强红色荧光,NP相上弱绿色荧光,其他位置未见明显荧光;植入4周、8周后取材切片,荧光显微镜下观察见AF细胞呈红色荧光标记的长梭形取向性生长,NP细胞呈绿色荧光标记的圆形或短梭形生长,交界区域未见两种细胞的明显迁移混合;HE染色可见支架内部有大量圆形或短梭形细胞;蕃红-O染色示AF相与NP相均呈阳性,NP相阳性强度强于AF相;AF相Ⅰ型胶原免疫组化染色、NP相Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性,且8周组染色阳性强度增强。力学性能分析显示细胞支架复合物压缩模量随植入时间增加而逐渐增加。结论:1.以天然丝素蛋白构建一体化AF-NP支架,具有良好的孔径、孔隙率和细胞相容性,具有优越的力学性能,适合作为组织工程椎间盘支架。2.湿纺-成形法制备环形取向性PCL微米纤维支架复合兔AF细胞能够构建在解剖结构、生化组成及力学性能上与天然纤维环组织相似的组织。3.以取向PCL纤维/海藻酸钠水凝胶复合兔椎间盘AF细胞和NP细胞在裸鼠皮下能够构建在微观结构、生化组成、力学性能上与天然椎间盘相似的组织工程化椎间盘。
【关键词】：椎间盘 组织工程 支架 丝素蛋白 聚己内酯(PCL) 海藻酸钠
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08;R681.53
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语11-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、丝素蛋白来源的一体化纤维环-髓核支架的制备与评估15-25
• 1.1 对象和方法15-19
• 1.1.1 实验材料及试剂15
• 1.1.2 实验试剂配制15-16
• 1.1.3 实验仪器16
• 1.1.4 实验方法16-19
• 1.2 结果19-23
• 1.2.1 丝素蛋白一体化AF-NP支架的评估19-20
• 1.2.2 一体化AF-NP支架的细胞相容性评估20-23
• 1.3 讨论23-24
• 1.3.1 组织工程椎间盘的特点23
• 1.3.2 支架材料研究进展和选择23
• 1.3.3 一体化支架的理化特性23-24
• 1.3.4 一体化支架的细胞相容性24
• 1.4 小结24-25
• 二、取向性聚己内酯纤维环支架复合兔纤维环细胞体外构建组织工程纤维环25-43
• 2.1 对象和方法25-34
• 2.1.1 实验材料及试剂25
• 2.1.2 实验试剂配制25-26
• 2.1.3 实验仪器26
• 2.1.4 实验方法26-34
• 2.2 结果34-40
• 2.2.1 环形取向PCL微米纤维环支架微观结构和理化性能评估34
• 2.2.2 组织工程纤维环中纤维环细胞行为评价34-35
• 2.2.3 组织学染色分析35
• 2.2.4 蛋白多糖、I型胶原、II型胶原定量分析35
• 2.2.5 纤维环细胞外基质的相关基因表达分析35
• 2.2.6 力学性能分析35-40
• 2.3 讨论40-42
• 2.3.1 取向PCL微米纤维支架的制备40
• 2.3.2 PCL微米纤维支架细胞行为的影响40-41
• 2.3.3 组织工程纤维环的形成41
• 2.3.4 力学性能分析41-42
• 2.4 小结42-43
• 三、裸鼠皮下构建仿生化组织工程椎间盘43-52
• 3.1 对象和方法43-45
• 3.1.1 实验材料及试剂43
• 3.1.2 实验试剂配制43
• 3.1.3 实验仪器43
• 3.1.4 实验方法43-45
• 3.2 结果45-50
• 3.2.1 大体观察45
• 3.2.2 活体荧光成像分析45
• 3.2.3 组织工程化椎间盘荧光检测45-46
• 3.2.4 组织学分析46
• 3.2.5 力学性能分析46-50
• 3.3 讨论50-51
• 3.3.1 仿生组织工程椎间盘的构建50
• 3.3.2 荧光标记与活体荧光成像50-51
• 3.3.3 裸鼠皮下异位构建仿生组织工程化椎间盘的可行性51
• 3.4 小结51-52
• 结论52-53
• 参考文献53-60
• 发表论文和参加科研情况说明60-62
• 综述 椎间盘退变信号转导机制的研究进展62-70
• 综述参考文献67-70
• 致谢70

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  本文关键词：组织工程纤维环-髓核复合组织的构建及评估，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：407425