医用壳多糖表面包覆技术处理纳米氧化铁磁珠的技术研发

发布时间：2017-06-04 10:07

  本文关键词：医用壳多糖表面包覆技术处理纳米氧化铁磁珠的技术研发，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景： 核酸是储存、复制和传递遗传信息的物质基础，是生物体正常的生长、发育、繁殖、以及遗传和变异等一系列重大生命活动的关键物质，同时参与生命体的各种病理活动。因此无论对核酸结构、功能进行研究，还是对基因工程、蛋白质工程等进行研究，对核酸进行分离纯化是首要解决的问题。核酸提取基本原理是利用各种方法，破裂细胞壁或细胞膜，使染色体及蛋白质发生变性反应，再用某些有机溶剂萃取核酸，然后经过沉淀、洗脱等过程，从而获取核酸。传统的核酸分离技术包含沉淀和离心等过程，该纯化方法的步骤繁杂、耗时长、提取率低，提取过程中会接触到有毒试剂，自动化程度低；而采用磁性载体微球分离技术则可较好的避免这些缺点，可实现核酸的高效、快速提取，是今后核酸纯化方法发展的一个重要方向。 纳米磁珠纯化技术与20世纪70年代兴起，纳米磁性颗粒因其独特的性能，在生物医学领域得到了广泛应用,如细胞分离、核酸提取、药物载体与免疫识别等。纳米磁珠一般由磁性内核及高分子外壳构成，可在磁场中定向运动，且可与多种活性物质结合，如抗原、核酸、抗体等结合，因此纳米磁珠是提取核酸优良的载体。纳米磁珠法提纯核酸不需要离心和使用有机溶剂，操作安全简单。但目前磁珠提取核酸分子的试剂盒以及仪器费用较高，难以在临床核酸提取中得到普及应用。因此，研发一种种基于纳米磁珠为介质的新型核酸吸附-提取技术具有重要的临床意义。我们根据传统核酸提取技术的不足，自主研发了基于现有比较成熟的磁珠提取技术-纳米氧化铁磁珠表面包覆医用壳聚糖新型磁珠的提取技术，为人体全血核酸的提取提供了简易便捷的新方法。 目的： 研制一种新型壳聚糖纳米氧化铁磁珠，检测其理化性能，并观察其在提取人血DNA检测中的应用效果。 方法： 采用凝聚沉淀的方法，通过在纳米氧化铁磁珠表面包覆一层壳聚糖分子，制备出壳聚糖纳米氧化铁磁珠。对磁珠的粒径大小、显微特征、壳聚糖外壳和磁珠内核的关系以及壳聚糖磁珠的理化性能进行检测、分析；采购人体全血标本，分别用壳多糖表面纳米氧化铁磁珠及硅基磁珠提取人血标本DNA，并用凝胶成像分析系统观察及核酸微量测定仪分析。结果： 1．电镜下观察壳聚糖表面包覆纳米氧化铁磁珠，磁珠分散性良好，无凝聚成团，覆盖约70%。 2．在透射电子显微镜下可见，壳聚糖纳米氧化铁磁珠呈圆形颗粒状，，形态、大小基本一致，磁珠分布均匀，粒径约在100~200nm之间。 3．XRD检测结果显示其衍射峰位置与标准参数相一致，这些特征峰衍射角2θ出现在18.5°、30.2°、35.6°、37.2°、43.0°、53.4°、57.1°和62.5°分别对应于的晶面指数(111)、(220)、(311)、(222)、(400)、(422)、(511)和(440)，而且没有其它杂质峰出现，说明样品中所含磁性核心为Fe3O4，单相立方晶型，产物纯度高。 4．红外光谱图显示，壳聚糖纳米氧化铁磁珠的特征吸收峰出现在约3400cm-1、2370cm-1、1630cm-1和1080cm-1处，这与壳聚糖所带的基分子间氢键、甲基、酮羰基、醇羟基相对应，证明壳聚糖被包覆在磁珠表面，且通过氢键范德华力和静电作用等方式结合。 5．过真空干燥后的粉末壳聚糖包覆纳米氧化铁磁珠的磁滞回线。结果显示磁珠的磁化强度在场强为-18000Oe时开始提高，-3000Oe~3000Oe区间提升最为明显，在20000Oe时基本达到饱和程度，该磁滞回线呈一条曲线、矫顽力趋近于零、几乎没有磁滞，具有良好的超顺磁性，饱和磁化强度为52.9emu/g。 6．壳聚糖纳米氧化铁磁珠在交变磁场中，随着时间的延长，其温度逐渐上升，温度与时间呈线性相关。 7．异丙醇替代液组的磁珠提取人血DNA电泳条带明显比原结合液组清晰，且异丙醇替代液组其260nm吸光度值（260nm Abs）及目标DNA浓度（conc）明显高于原结合液组，证明异丙醇在DNA提取过程中起到了优化作用。 8．壳聚糖纳米氧化铁磁珠每条跑道上均可见DNA条带片段，硅基磁珠电泳条带更清晰、明亮；壳聚糖纳米氧化铁磁珠组其260nm Abs及conc值均明显低于硅基纳米氧化铁磁珠组（p＜0.05），提示壳聚糖纳米氧化铁磁珠提取的全血DNA浓度较低，提取效果不如硅基纳米氧化铁磁珠。同时发现，壳聚糖纳米氧化铁磁珠组其OD260/280为1.8713±0.0825，提示不存在RNA、蛋白质、酚等污染，但OD260/230为0.4613±0.0770，明显低于2.0，提示提取的DNA样品中可能有盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等污染。 结论： 成功制备了新型壳聚糖纳米氧化铁磁珠，其操作简便、易行，制备出的壳聚糖纳米氧化铁磁珠粒径均匀，成球性与稳定性好，且成功提取了人血DNA，为靶向药物载体、细胞分离、核酸提取等应用提供了实验材料，但仍比较硅基提取效果差，其提纯浓度和纯度并非十分理想，提取方法值得继续深入研究。
【关键词】：壳聚糖纳米氧化铁磁珠 制备 沉淀 理化性能 核酸 氧化铁
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 缩略语表4-5
• Abstract5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 壳聚糖表面包覆纳米氧化铁磁珠的制备及理化性能的测定15-24
• 2.1 材料与方法15-17
• 2.2 结果17-21
• 2.3 讨论21-24
• 第三章 壳聚糖包覆纳米氧化铁磁珠在临床检验中的应用24-32
• 3.1 材料和方法25-28
• 3.2 结果28-31
• 3.3 讨论31-32
• 全文总结32-33
• 参考文献33-44
• 文献综述44-53
• 参考文献50-53
• 攻读学位期间发表的论文53-54
• 致谢54

【参考文献】

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本文编号：420657