共培养技术用于体外构建组织工程软骨的实验研究
发布时间：2017-06-07 02:12
本文关键词：共培养技术用于体外构建组织工程软骨的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：一、人骨髓间充质干细胞与人软骨细胞的分离培养 目的：探索人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）与人软骨细胞（human Articular Chontrocytes，hACs）的体外分离及培养过程，并对其进行鉴定；尝试利用转化因子β1（Transforming growth factorβ1，TGF-β1）诱导hBMSCs向软骨细胞分化。 方法：取5～8岁儿童四肢长骨骨折需髓内钉固定者，抽吸其钻孔后流出的骨髓，通过分离、离心获得细胞，采用低糖DMEM培养基进行体外培养，采取流式细胞仪对培养的细胞进行鉴定；使用倒置显微镜观测细胞形态及生长状况，绘制hBMSCs生长曲线。利用TGF-β1诱导hBMSCs向软骨细胞分化。对诱导后的细胞进行阿利新蓝染色、蕃红花-亮绿染色检测细胞蛋白聚糖Aggrecan，GAG），免疫组织化学染色检测II型胶原。取多指（趾）患儿切除下来的关节软骨，分离、消化获得软骨细胞，，鉴定同hBMSCs诱导软骨细胞。 结果：hBMSCs呈现贴壁生长，约2ml骨髓中获得的hBMSCs经10天左右可长满六孔板的一孔。传代后，其第一代～第五代生长旺盛，培养至二十代渐出现凋亡。第三代hBMSCs经流式细胞仪检测CD34、CD45表达阴性，CD29表达阳性。利用TGF-β1诱导后的hBMSCs其阿利新蓝、蕃红花-亮绿及免疫组化II型胶原染色表达阳性。 多指（趾）软骨细胞2周长满六孔板的一孔。鉴定结果同hBMSCs诱导软骨细胞。 结论：1、在体外成功分离、培养了hBMSCs和hACs。 2、hBMSCs可来源于5～8岁儿童四肢长骨骨髓。 3、成功利用转化因子β1诱导hBMSCs分化成软骨细胞。 二、人骨髓间充质干细胞与人软骨细胞共混培养体外构建组织工程软骨 目的：研究hACs与hBMSCs直接接触共培养的最佳比例；比较混合培养与TGF-β1诱导hBMSCs体外构建组织工程软骨的效果。 方法：取上述分离培养后第三代hBMSCs和第三代hACs以2：1、1：1、1：2的比例共培养并接种于丝素蛋白支架（实验组A、B、C）。同时建立诱导剂诱导第三代hBMSCs向软骨细胞分化并接种于丝素支架的对照组D；建立单纯第三代hACs接种于丝素支架的对照组E。保持各组细胞总数一致。将细胞-支架复合物进行体外培养3周，采用倒置显微镜、大体形态、组织学HE染色、II型胶原染色、阿利新蓝比色法测GAG含量及Hoechst33258荧光法行DNA定量分析进行观察。 结果：各组细胞在丝素蛋白三维支架上均生长良好；各组细胞支架复合物外观大小无明显差异。A组（hBMSCs：hACs=2：1）与D组（TGF-β1诱导组）形成的细胞支架复合物弹性、光泽较差，组织学染色见细胞增殖少，细胞外基质分泌水平较低，GAG与DNA定量分析结果低于其他三组。C组（hBMSCs：hACs=1：2）构建的细胞支架复合物具有最佳的弹性与光泽，组织学染色见细胞支架结合紧密，细胞增殖较多，胞外基质丰富，GAG与DNA定量分析结果最高。B组（hBMSCs：hACs=1：1）与E组（单纯hACs组）体外构建的组织工程软骨质量相当。 结论：1、hBMSCs与hACs之间的相互作用有利于软骨细胞外基质的产生，比例为2：1时即可获得与TGF-β1诱导hBMSCs相当的成软骨效应。 2、hBMSCs与hACs直接接触共培养比例为1：2时具有最佳的成软骨效应。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 软骨细胞 诱导 组织工程软骨 共培养
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.1
【目录】：
- 中文摘要4-6
- Abstract6-10
- 前言10-12
- 材料和仪器准备12-14
- 第一部分 人骨髓间充质干细胞与人软骨细胞的分离培养14-22
- 一、实验方法14-16
- 二、实验结果16-17
- 三、讨论17-21
- 四、结论21-22
- 第二部分 人骨髓间充质干细胞与人软骨细胞共混培养体外构建组织工程软骨22-34
- 一、实验方法22-25
- 二、实验结果25-28
- 三、讨论28-32
- 四、结论32-34
- 附图34-41
- 参考文献41-48
- 综述48-61
- 参考文献55-61
- 攻读学位期间公开发表的论文61-62
- 中英文缩写词表62-63
- 致谢63-64
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 黄粤;戴丽冰;钟晓e
本文编号：427985
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/swyx/427985.html
