低强度脉冲超声优化组织工程化软骨的构建及其修复关节软骨缺损的实验研究

发布时间：2017-06-08 12:07

  本文关键词：低强度脉冲超声优化组织工程化软骨的构建及其修复关节软骨缺损的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的： 随着交通的日益发达与体育运动的不断普及,关节软骨损伤的发病率呈递增趋势,加之人口老龄化产生的大量骨关节炎的患者,使得软骨缺损修复一度成为临床及相关基础研究中亟待解决的难题之一,目前经典的全层透明软骨修复方法大部分不能达到预期的疗效,因此,研究人员和医生必须找出一个可靠的方法。近年来,组织工程技术的出现为人们带来了新的希望。本研究选取藻酸钙作为载体、软骨细胞作为种子细胞,在低强度脉冲超声(Low-intensive Pulsed Ultrasound, LIPUS)的干预下构建组织工程化软骨,并探讨其对兔膝关节软骨缺损的修复作用,为治疗软骨缺损提供一个新思路。 方法： 1、选取2周龄的新西兰大白兔,无菌操作下切取双膝关节软骨,采用机械法联合酶一步消化法分离软骨细胞并进行培养,对培养的软骨细胞进行生物学鉴定(甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色)。 2、将软骨细胞与海藻酸钠混合制成细胞悬液,调整细胞密度为5×106/ml,加入足量的Cacl2,混匀后放入特定的模型中制作成特定形状的软骨细胞／藻酸钙凝胶复合物。 3、将制备好的凝胶分组施加LIPUS刺激,空白组(无超声)；低强度超声组(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:50mv, Cycle:50);中强度超声组(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:75mv, Cycle:50);高强度超声组(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:100mv, Cycle:50),干预三天后通过CCK-8及免疫组化检测细胞的增殖情况、Ⅱ型胶原的表达量,从而筛选出最佳的超声参数。 4、选取27只28～35周龄的新西兰大白兔,采用适当的方法制造兔股骨髁间窝直径约为3mm,深3mm的圆柱形软骨缺损模型,将兔子分为模型组(Control)、普通藻酸钙组(LIPUS-)及超声藻酸钙组(LIPUS+)。在藻酸钙组及超声藻酸钙组中分别填入对应的凝胶,分别于4、8、12周处死兔子,切取股骨远端进行大体观察及病理学观察,对组织切片进行HE染色、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色,并进行wakitani评分。 结果： 1、通过机械法联合酶消化法可顺利的分离出软骨细胞,一定的培养条件下,培养至2-3代的细胞生长能力强、细胞外基质分泌旺盛,可作为种子细胞。 2、软骨细胞可较好的在藻酸钙中生长、增殖,低、中强度组的超声能够促进软骨细胞在三维培养环境下的生长及Ⅱ型胶原的表达,低强度组超声(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:50mv, Cycle:50)的促进作用更为明显,而高强度组的LIPUS则抑制了细胞的生长及Ⅱ型胶原的表达。 3、第4、8、12周时大体观察及组织学观察提示LIPUS-及LIPUS+的缺损区为透明软骨样组织,而Control则多为纤维样软骨组织,同一时期的LIPUS+修复效果较LIPUS-好。各组的wakitani组织学评分随时间推移而呈现递减趋势,4周时LIPUS+与Control相比有明显差异(P0.01),LIPUS-组与Control比具有统计学差异(P小于0.05),但LIPUS+与LIPUS-相比无统计学差异(P0.05),8、12周时两治疗组与Control相比均有明显差异(P0.01),两治疗组间相比具有统计学差异(P0.05)。 结论： 1、利用机械法联合酶消化法能获得大量生物活性强的软骨细胞。 2、采用本实验中的方法可制备出符合实验需求的、具有特定形状的软骨细胞／藻酸钙凝胶复合物。一定强度的超声(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:50mv, Cycle:50)能够优化组织工程化软骨的构建。 3、软骨细胞／藻酸钙凝胶复合物及LIPUS优化的凝胶复合物均可通过促进软骨缺损修复区的软骨细胞增殖、Ⅱ型胶原等细胞外基质的分泌、降低wakitani评分从而起到修复软骨缺损的作用,相比较而言,LIPUS优化的凝胶复合物修复软骨缺损的效果更为显著。
【关键词】：低强度脉冲超声 组织工程化软骨 软骨缺损 修复
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 英汉缩略语名词对照12-13
• 前言13-15
• 第一部分 兔膝关节软骨细胞的原代培养及鉴定15-23
• 1 实验目的15
• 2 实验材料15-16
• 2.1 实验动物15
• 2.2 主要实验器械15
• 2.3 实验耗材与仪器15
• 2.4 主要试剂及药物15-16
• 2.5 主要试剂的配制16
• 3 实验方法及步骤16-18
• 3.1 软骨细胞的体外分离及培养16-17
• 3.2 软骨细胞的传代培养17
• 3.3 软骨细胞的冻存17
• 3.4 软骨细胞形态学观察及功能学特性的鉴定17-18
• 3.4.1 软骨细胞的镜下观察17
• 3.4.2 细胞爬片的制备17-18
• 3.4.3 甲苯胺蓝染色18
• 3.4.4 Ⅱ型胶原免疫组化染色18
• 4 结果18-19
• 4.1 倒置显微镜下观察18-19
• 4.2 软骨细胞功能学特性的鉴定19
• 4.2.1 甲苯胺蓝染色19
• 4.2.2 Ⅱ型胶原免疫组织化学19
• 5 讨论19-20
• 5.1 关节软骨缺损修复的种子细胞19-20
• 5.2 软骨细胞的分离方法20
• 5.3 软骨细胞的体外培养20
• 6 结论20-21
• 附图21-23
• 第二部分 软骨细胞/藻酸钙凝胶复合物的配制及优化凝胶复合物的最佳超声参数筛选23-33
• 1 实验目的23
• 2 实验材料23-24
• 2.1 种子细胞23
• 2.2 主要实验器械23
• 2.3 实验耗材与仪器23
• 2.4 主要试剂及药物23-24
• 2.5 主要试剂的配制24
• 3 实验方法及步骤24-25
• 3.1 制备藻酸钠/软骨细胞悬液24
• 3.2 制备圆柱形软骨细胞/藻酸钙凝胶复合物24-25
• 3.3 筛选最佳超声参数改良软骨细胞/藻酸钙凝胶复合物25
• 4 主要检测指标25
• 4.1 CCK-8检测软骨细胞数量25
• 4.2 免疫组化检测软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达量25
• 5 统计学处理25-26
• 6 结果26-28
• 6.1 CCK-8检测不同组别凝胶内软骨细胞数量26
• 6.2 免疫组化检测不同组别凝胶中软骨细胞Ⅱ型胶原表达情况26-28
• 7 讨论28-30
• 7.1 三维培养的意义28
• 7.2 三维培养的支架材料28
• 7.3 构建组织工程化软骨的种子细胞浓度28-29
• 7.4 超声优化软骨细胞/藻酸钙凝胶复合物的构建29-30
• 8 结论30-31
• 附图31-33
• 第三部分 经超声优化的软骨细胞/藻酸钙凝胶复合物修复兔膝关节软骨缺损33-46
• 1 实验目的33
• 2 实验材料33-34
• 2.1 实验动物33
• 2.2 主要实验器械33
• 2.3 实验耗材与仪器33
• 2.4 主要试剂及药物33-34
• 2.5 主要试剂的配制34
• 3 实验方法及步骤34-35
• 3.1 软骨细胞/藻酸钙凝胶复合物的制备及超声干预34
• 3.2 制造兔膝关节软骨缺损模型34-35
• 3.3 实验分组35
• 4 主要观察指标35-37
• 4.1 一般情况观察35
• 4.2 修复组织的大体观察35
• 4.3 修复组织的组织学观察35-36
• 4.3.1 标本的HE染色35
• 4.3.2 番红O染色35-36
• 4.3.3 Ⅱ型胶原免疫组织化学36
• 4.4 组织学评分36-37
• 5 统计学处理37
• 6 结果37-39
• 6.1 一般情况观察37
• 6.2 修复组织大体观察37-38
• 6.3 修复组织的组织学观察38
• 6.4 组织学评分38-39
• 7 讨论39-41
• 7.1 实验动物麻醉剂的选择及模型的制备39-40
• 7.2 软骨损伤的中医药治疗40
• 7.3 LIPUS的类生长因子作用40-41
• 8 结论41-42
• 附图42-46
• 参考文献46-50
• 第四部分 结论与展望50-51
• 1 结论50
• 2 展望50-51
• 综述51-57
• 参考文献54-57
• 攻读硕士期间获得的研究成果57-58
• 致谢58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王小红;王洪;杨述华;唐欣;段德宇;孟春庆;邵增务;杜靖远;;低强度脉冲式超声对实验性兔骨关节炎软骨损伤修复的影响[J];国际骨科学杂志;2009年03期

2 万洁;许崇泰;;乌拉坦在生理科学实验中对家兔麻醉效果的研究[J];辽宁医学院学报;2009年06期

3 蒋欣益;杨霁;柴召午;宋锦t

本文编号：432440