生物素作为抗癌药物靶向配体的研讨进展
发布时间：2014-11-13 21:38
第 1 章 绪 论
近年来药物载体成为研究最热门的范畴之一[1,2]，其缘故原由不但是由于它有利于药物疗效的进步，毒副作用的低落，更重要的是由于它可以到达某种缓控释的结果，从而减轻病人多次用药的痛楚。在药物缓控释的体系中，除了药物所发挥的作用外，药物载体质料也饰演着举足轻重的脚色。现在，药物载体质料重要是高分子质料，包罗自然高分子质料和合成的高分子质料。此中自然高分子质料因其自身的可降解性、精良的生物相容性以及可从体内宁静消除等特性受到研究者们的青睐。自然高分子质料重要有卵白、多肽和多糖类，而多糖类作为药物载体的研究不停备受存眷[3,4]。
作为一种天然来源的生物材料，多糖来源广泛、廉价易得、结构稳定、安全无毒、具有亲水性、可降解性等特点，尤其是大部分多糖含有亲水性基团可以和生物组织非共价结合，因而可以延长药物在体内的滞留时间从而增加药物吸收。更重要的一点是，多糖类结构中富含羧基（-COOH）、羟基（-OH）以及氨基（-NH2）等亲水性基团，很容易连接上不同的基团使其性质和作用发生巨大变化，生成具有生物活性的衍生物。例如：接枝上疏水性的基团可以改善其亲水性的特性使其具有两亲性[5]，接枝上聚合物长链延长体内循环时间[6]，接枝上靶向配体则使得该材料具备组织靶向性[7]，多糖的所有这些优点被学者们广泛应用于药物载体材料的研究。
........................
1.1 普鲁兰糖简介
普鲁兰糖（Pullulan），作为多糖的一种，是出芽孢梗霉孕育发生的胞外多糖，以 α-1,4糖苷键联合的麦芽三糖，两头再以 α-1,6 糖苷键同别的的麦芽三糖重复毗连而成的高分子线性多糖[8]，布局式见图 1-1。普鲁兰糖无色、无味、富含羟基，极易溶于水和 DMSO，不溶于常见醇类、丙酮、醚和氯仿等有机溶剂。普鲁兰糖宁静无毒、无免疫原性，无致畸作用，具有精良生物相容性、可生物降解性等诸多长处，被视作为一种精良的生物质料运用在药物传送体系和构造工程等范畴[9-11]。
由于普鲁兰多糖分子上有大量的羟基，因此性质比较活泼，可以进行多种化学修饰。例如，可以通过酯化、羧甲基化[12,13]、乙酰化[14]等多种反应将疏水性的侧链接枝到主链上，形成部分疏水改性的普鲁兰糖。
目前，对于普鲁兰糖疏水改性后作为药物载体材料的报道屡见不鲜[15,16]。其中，胆固醇，这个疏水性物质作为内源小分子接枝到普鲁兰糖链上，使之获得具有两亲性质的胆甾醇基普鲁兰糖（CHP）材料的相关研究亦是层出不穷[17,18]。由于普鲁兰糖水溶性极好，而接枝上胆甾醇后能够在水中自组装成 CHP 凝胶纳米粒，这一现象引发了众多学者的极大热情。Akiyoshi[19]等用 1,6-己二异氰酸酯为连接臂，将胆甾醇键合到不同分子量普鲁兰糖链上，获得系列不同取代度的胆甾醇基普鲁兰糖（CHP）；Yang[20]等选用三羧酸循环的中间产物-琥珀酸这个内源性物质作为普鲁兰糖疏水改性的连接臂，合成了胆甾醇基普鲁兰糖（CHSP），其用作药物载体，理论上更具安全性。因而，胆甾醇基普鲁兰糖衍生物在医药领域中的应用日益受到研究者们的重视。
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第 2 章 生物素化胆甾醇基普鲁兰糖（Bio-CHSP）材料合成、表征及其自聚集纳米粒的制备
2.1 引言
普鲁兰糖（Pullulan）是出芽短梗霉发酵产生的胞外多糖，由于其安全无毒、无免疫原性、易生物降解，多羟基易化学改性等众多特性，近年来在药物载体方面受到众多学者的关注。其中，Yang[20]等人通过对其化学改性制成胆甾醇基普鲁兰糖（CHSP），该材料由于具有两亲性，能够在水中自聚集成为纳米粒，有望成为生物医药载体。
本章中在此研究基础上，对该材料进一步化学修饰，通过酯化作用合成不同生物素取代度的生物素化胆甾醇基普鲁兰糖 Bio-CHSP-20.1、Bio-CHSP-29.2、Bio-CHSP-38.9，并通过红外光谱（FT-IR）、核磁共振氢谱（1H-NMR）以及 X 射线粉末衍射（XRD）对 Bio-CHSP进行结构表征。同时考察了 Bio-CHSP-20.1、Bio-CHSP-29.2、Bio-CHSP-38.9在水中的自聚集行为，并对纳米粒的形态、粒径分布和 Zeta 电位进行了研究和表征，为下一章包载疏水性抗癌药物打下基础。
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2.2 试剂及仪器
2.2.1 材料及试剂
普鲁兰多糖（Mw:200 000，日本林原化学株式会社）；4-二甲氨基吡啶（DMAP，Aldrich 公司）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC，上海共价化学科技有限公司）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，Sigma 公司）；琥珀酸酐（天津市福晨化学试剂厂）；胆甾醇（分析纯，北京鼎国生物技术有限责任公司）；生物素（国药集团上海化学试剂有限公司）；透析袋（Mw 8-14 KDa，北京新泽科技有限公司）；无水乙醇、二甲亚砜（DMSO）、四氢呋喃（THF）、无水吡啶等均购于天津市科密欧化学试剂有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
............................
第3章 载药 Bio-CHSP 纳米粒的制备、表征及体外释放............... 26-35
3.1 引言 ...................26
3.2 试剂及仪器 ...........................26
3.2.1 材料及试剂 ......................26
3.2.2 仪器设备......................... 26
3.3 实验方法 ..................................26-28
3.3.1 载药米托蒽醌纳米粒（MTO/Bio-CHSP）的制备.............. 26-27
3.3.2 载药纳米粒包封率（LE%）与载药量（LC%）的测定...................... 27
3.3.3 载药 Bio-CHSP 自聚集纳米粒的透射电镜表征..................... 27
3.3.4 载药 Bio-CHSP 自聚集纳米粒粒径分布及 Zeta 电位的测定.............. 27
3.3.5 载药 Bio-CHSP 自聚集纳米粒 XRD 粉末衍射分析........................ 27
3.3.6 载药 Bio-CHSP 自聚集纳米粒的体外释放 .................27-28
3.4 结果与讨论 ..........................28-34
3.4.1 MTO 标准曲线的建立.................. 28-29
3.4.2 载药纳米粒的制备.................. 29-30
3.4.3 MTO 在 Bio-CHSP 中的存在形式及载药纳米粒的表征........... 30-32
3.4.4 载药纳米粒体外释放实验 ...............32-34
3.5 结论............................ 34-35
第4章 Bio-CHSP 纳米粒小鼠体内安全性的初步评价
4.1 引言
接纳生物相容性纳米载体质料负载药物表现出很多长处，但迩来研究表现，应用纳米质料也具有潜伏毒性，比方：肺毒性、皮肤毒性、载药后引发的细胞毒性和遗传毒性等日渐受到研究者存眷[85-87]。故观察纳米载体质料的生物宁静性尤为紧张。以毒理学研究为底子的纳米宁静性评价报道日益增多[88-91]。文献报道[91]小鼠尾静脉注射 200 mg/kg乙酰普鲁兰糖纳米粒溶液，急毒实行表现，实行组小鼠体重和食量与比较组相比未见非常，试验时期未见动物去世亡，小鼠各脏器的构造切片亦无病理变革，由此得出，乙酰普鲁兰糖作为纳米载体质料，具备开端生物宁静性。
本部分将 Bio-CHSP NPs 纳米溶液，经尾静脉注射于小鼠体内，观察动物的体征、体重、食量及主要脏器病理切片，验证 Bio-CHSP 材料初步生物安全性。
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总结
胆甾化的普鲁兰糖（CHSP）具有良好的生物相容性，由于其具有两亲性，在水中可以通过疏水作用自聚集形成纳米粒，是疏水性药物尤其是抗肿瘤药物的优良载体。为设计其为靶向载体，通过酯化反应，在 CHSP 材料上连接生物素靶头，合成不同取代度的生物素化胆甾醇基普鲁兰糖（Bio-CHSP），并对其进行表征。采用新型 Bio-CHSP 材料自聚集纳米粒负载抗癌药物米托蒽醌，考察其体外释放；小鼠尾静脉注射 Bio-CHSP纳米溶液，初步评价 Bio-CHSP 材料的生物安全性。全文总结如下：
1. 采用酯化反应，将生物素化学键合到胆甾醇基普鲁兰糖分子链上，经 FT-IR、1H-NMR、 XRD 表征证明，成功合成不同取代度的生素素化胆甾醇基普鲁兰糖（Bio-CHSP），1H-NMR 法测定生物素取代度；透析法制备其自聚集纳米粒，经荧光光谱、透射电镜及动态光散射检测，该材料可自聚集成粒径均匀的 100~180 nm球形纳米粒；稳态荧光法测得临界聚集浓度，其与生物素取代度具有负相关性。
2. 米托蒽醌（MTO）为模型药物，制备表征负载 MTO 的 Bio-CHSP 材料纳米粒。结果表明：MTO/Bio-CHSPNPs 包封率均超过 80%，粒径均匀，载药纳米粒体外释放，呈现双相释放，明显延缓 MTO 的体外释放，故 Bio-CHSP 可用作抗癌药物的缓释载体。
3. 通过尾静脉注射 Bio-CHSP 纳米粒溶液，对比小鼠的生长、食量及切片，综合评价 Bio-CHSP 材料的动物体内安全性。实验显示：实验组与对照组没有显著差异，在 200mg/kg 小鼠尾静脉注射 Bio-CHSP 纳米溶液，未见明显毒性。故初步证明 Bio-CHSP 材料具备一定生物安全性，为下一步的实验细胞及肿瘤靶向实验奠定基础。
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参考文献（略）
本文编号：10073
近年来药物载体成为研究最热门的范畴之一[1,2]，其缘故原由不但是由于它有利于药物疗效的进步，毒副作用的低落，更重要的是由于它可以到达某种缓控释的结果，从而减轻病人多次用药的痛楚。在药物缓控释的体系中，除了药物所发挥的作用外，药物载体质料也饰演着举足轻重的脚色。现在，药物载体质料重要是高分子质料，包罗自然高分子质料和合成的高分子质料。此中自然高分子质料因其自身的可降解性、精良的生物相容性以及可从体内宁静消除等特性受到研究者们的青睐。自然高分子质料重要有卵白、多肽和多糖类，而多糖类作为药物载体的研究不停备受存眷[3,4]。
作为一种天然来源的生物材料，多糖来源广泛、廉价易得、结构稳定、安全无毒、具有亲水性、可降解性等特点，尤其是大部分多糖含有亲水性基团可以和生物组织非共价结合，因而可以延长药物在体内的滞留时间从而增加药物吸收。更重要的一点是，多糖类结构中富含羧基（-COOH）、羟基（-OH）以及氨基（-NH2）等亲水性基团，很容易连接上不同的基团使其性质和作用发生巨大变化，生成具有生物活性的衍生物。例如：接枝上疏水性的基团可以改善其亲水性的特性使其具有两亲性[5]，接枝上聚合物长链延长体内循环时间[6]，接枝上靶向配体则使得该材料具备组织靶向性[7]，多糖的所有这些优点被学者们广泛应用于药物载体材料的研究。
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1.1 普鲁兰糖简介
普鲁兰糖（Pullulan），作为多糖的一种，是出芽孢梗霉孕育发生的胞外多糖，以 α-1,4糖苷键联合的麦芽三糖，两头再以 α-1,6 糖苷键同别的的麦芽三糖重复毗连而成的高分子线性多糖[8]，布局式见图 1-1。普鲁兰糖无色、无味、富含羟基，极易溶于水和 DMSO，不溶于常见醇类、丙酮、醚和氯仿等有机溶剂。普鲁兰糖宁静无毒、无免疫原性，无致畸作用，具有精良生物相容性、可生物降解性等诸多长处，被视作为一种精良的生物质料运用在药物传送体系和构造工程等范畴[9-11]。
由于普鲁兰多糖分子上有大量的羟基，因此性质比较活泼，可以进行多种化学修饰。例如，可以通过酯化、羧甲基化[12,13]、乙酰化[14]等多种反应将疏水性的侧链接枝到主链上，形成部分疏水改性的普鲁兰糖。
目前，对于普鲁兰糖疏水改性后作为药物载体材料的报道屡见不鲜[15,16]。其中，胆固醇，这个疏水性物质作为内源小分子接枝到普鲁兰糖链上，使之获得具有两亲性质的胆甾醇基普鲁兰糖（CHP）材料的相关研究亦是层出不穷[17,18]。由于普鲁兰糖水溶性极好，而接枝上胆甾醇后能够在水中自组装成 CHP 凝胶纳米粒，这一现象引发了众多学者的极大热情。Akiyoshi[19]等用 1,6-己二异氰酸酯为连接臂，将胆甾醇键合到不同分子量普鲁兰糖链上，获得系列不同取代度的胆甾醇基普鲁兰糖（CHP）；Yang[20]等选用三羧酸循环的中间产物-琥珀酸这个内源性物质作为普鲁兰糖疏水改性的连接臂，合成了胆甾醇基普鲁兰糖（CHSP），其用作药物载体，理论上更具安全性。因而，胆甾醇基普鲁兰糖衍生物在医药领域中的应用日益受到研究者们的重视。
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第 2 章 生物素化胆甾醇基普鲁兰糖（Bio-CHSP）材料合成、表征及其自聚集纳米粒的制备
2.1 引言
普鲁兰糖（Pullulan）是出芽短梗霉发酵产生的胞外多糖，由于其安全无毒、无免疫原性、易生物降解，多羟基易化学改性等众多特性，近年来在药物载体方面受到众多学者的关注。其中，Yang[20]等人通过对其化学改性制成胆甾醇基普鲁兰糖（CHSP），该材料由于具有两亲性，能够在水中自聚集成为纳米粒，有望成为生物医药载体。
本章中在此研究基础上，对该材料进一步化学修饰，通过酯化作用合成不同生物素取代度的生物素化胆甾醇基普鲁兰糖 Bio-CHSP-20.1、Bio-CHSP-29.2、Bio-CHSP-38.9，并通过红外光谱（FT-IR）、核磁共振氢谱（1H-NMR）以及 X 射线粉末衍射（XRD）对 Bio-CHSP进行结构表征。同时考察了 Bio-CHSP-20.1、Bio-CHSP-29.2、Bio-CHSP-38.9在水中的自聚集行为，并对纳米粒的形态、粒径分布和 Zeta 电位进行了研究和表征，为下一章包载疏水性抗癌药物打下基础。
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2.2 试剂及仪器
2.2.1 材料及试剂
普鲁兰多糖（Mw:200 000，日本林原化学株式会社）；4-二甲氨基吡啶（DMAP，Aldrich 公司）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC，上海共价化学科技有限公司）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，Sigma 公司）；琥珀酸酐（天津市福晨化学试剂厂）；胆甾醇（分析纯，北京鼎国生物技术有限责任公司）；生物素（国药集团上海化学试剂有限公司）；透析袋（Mw 8-14 KDa，北京新泽科技有限公司）；无水乙醇、二甲亚砜（DMSO）、四氢呋喃（THF）、无水吡啶等均购于天津市科密欧化学试剂有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
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第3章 载药 Bio-CHSP 纳米粒的制备、表征及体外释放............... 26-35
3.1 引言 ...................26
3.2 试剂及仪器 ...........................26
3.2.1 材料及试剂 ......................26
3.2.2 仪器设备......................... 26
3.3 实验方法 ..................................26-28
3.3.1 载药米托蒽醌纳米粒（MTO/Bio-CHSP）的制备.............. 26-27
3.3.2 载药纳米粒包封率（LE%）与载药量（LC%）的测定...................... 27
3.3.3 载药 Bio-CHSP 自聚集纳米粒的透射电镜表征..................... 27
3.3.4 载药 Bio-CHSP 自聚集纳米粒粒径分布及 Zeta 电位的测定.............. 27
3.3.5 载药 Bio-CHSP 自聚集纳米粒 XRD 粉末衍射分析........................ 27
3.3.6 载药 Bio-CHSP 自聚集纳米粒的体外释放 .................27-28
3.4 结果与讨论 ..........................28-34
3.4.1 MTO 标准曲线的建立.................. 28-29
3.4.2 载药纳米粒的制备.................. 29-30
3.4.3 MTO 在 Bio-CHSP 中的存在形式及载药纳米粒的表征........... 30-32
3.4.4 载药纳米粒体外释放实验 ...............32-34
3.5 结论............................ 34-35
第4章 Bio-CHSP 纳米粒小鼠体内安全性的初步评价
4.1 引言
接纳生物相容性纳米载体质料负载药物表现出很多长处，但迩来研究表现，应用纳米质料也具有潜伏毒性，比方：肺毒性、皮肤毒性、载药后引发的细胞毒性和遗传毒性等日渐受到研究者存眷[85-87]。故观察纳米载体质料的生物宁静性尤为紧张。以毒理学研究为底子的纳米宁静性评价报道日益增多[88-91]。文献报道[91]小鼠尾静脉注射 200 mg/kg乙酰普鲁兰糖纳米粒溶液，急毒实行表现，实行组小鼠体重和食量与比较组相比未见非常，试验时期未见动物去世亡，小鼠各脏器的构造切片亦无病理变革，由此得出，乙酰普鲁兰糖作为纳米载体质料，具备开端生物宁静性。
本部分将 Bio-CHSP NPs 纳米溶液，经尾静脉注射于小鼠体内，观察动物的体征、体重、食量及主要脏器病理切片，验证 Bio-CHSP 材料初步生物安全性。
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总结
胆甾化的普鲁兰糖（CHSP）具有良好的生物相容性，由于其具有两亲性，在水中可以通过疏水作用自聚集形成纳米粒，是疏水性药物尤其是抗肿瘤药物的优良载体。为设计其为靶向载体，通过酯化反应，在 CHSP 材料上连接生物素靶头，合成不同取代度的生物素化胆甾醇基普鲁兰糖（Bio-CHSP），并对其进行表征。采用新型 Bio-CHSP 材料自聚集纳米粒负载抗癌药物米托蒽醌，考察其体外释放；小鼠尾静脉注射 Bio-CHSP纳米溶液，初步评价 Bio-CHSP 材料的生物安全性。全文总结如下：
1. 采用酯化反应，将生物素化学键合到胆甾醇基普鲁兰糖分子链上，经 FT-IR、1H-NMR、 XRD 表征证明，成功合成不同取代度的生素素化胆甾醇基普鲁兰糖（Bio-CHSP），1H-NMR 法测定生物素取代度；透析法制备其自聚集纳米粒，经荧光光谱、透射电镜及动态光散射检测，该材料可自聚集成粒径均匀的 100~180 nm球形纳米粒；稳态荧光法测得临界聚集浓度，其与生物素取代度具有负相关性。
2. 米托蒽醌（MTO）为模型药物，制备表征负载 MTO 的 Bio-CHSP 材料纳米粒。结果表明：MTO/Bio-CHSPNPs 包封率均超过 80%，粒径均匀，载药纳米粒体外释放，呈现双相释放，明显延缓 MTO 的体外释放，故 Bio-CHSP 可用作抗癌药物的缓释载体。
3. 通过尾静脉注射 Bio-CHSP 纳米粒溶液，对比小鼠的生长、食量及切片，综合评价 Bio-CHSP 材料的动物体内安全性。实验显示：实验组与对照组没有显著差异，在 200mg/kg 小鼠尾静脉注射 Bio-CHSP 纳米溶液，未见明显毒性。故初步证明 Bio-CHSP 材料具备一定生物安全性，为下一步的实验细胞及肿瘤靶向实验奠定基础。
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参考文献（略）
本文编号：10073
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/yiyaoxuelunwen/10073.html
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