基于ABCB1和ABCG2靶点LS-2-3j逆转肿瘤多药耐药的作用及机制研究

发布时间：2020-11-16 04:53

　　癌症是目前世界范围一大公共卫生问题,一直以来严重威胁人类健康。化疗作为一种重要的癌症治疗手段,在临床上失败的现象时有发生。而肿瘤细胞多药耐药现象的产生是癌症化疗失败主要原因之一。ABCB1和ABCG2蛋白作为ABC转运体超家族的成员,在介导肿瘤细胞多药耐药产生的过程中起着重要作用。基于两者在肿瘤细胞中分布的广泛性以及作用机理的明确性,ABCB1及ABCG2一直以来都是临床前研究及临床治疗的重要靶点。前期工作中我们通过MTT法对17种新合成化合物的逆转耐药活性进行了初步检测。最终筛选出活性较好的LS-2-3j作为研究对象。LS-2-3j(10-oxo-5-(3-(pyrrolidin-1-yl)propyl)-5,10-dihydroindeno[1,2-b]indol-9-yl propionate)是一种新型合成的吲哚类衍生物,本论文对其逆转耐药作用及机制展开了研究工作。我们利用细胞稳定转染技术,构建了 ABCG2过表达的多药耐药细胞株MCF-7/ABCG2 及293T/ABCG2,并通过 Western Blot检测了细胞株内 ABCG2的表达水平。其次,采用MTT法检测化合物LS-2-3j对ABCB1或ABCG2过表达多药耐药细胞、化疗药物敏感细胞以及正常细胞的细胞毒性,结果表明LS-2-3j对正常细胞的细胞毒性小于肿瘤细胞。然后,我们选出LS-2-3j对上述细胞株的细胞存活率大于80%的化合物浓度(0.25 μmol/L、0.5μmol/L和1 μmol/L),采用MTT法检测LS-2-3j在不同浓度下对多药耐药细胞的逆转耐药倍数。结果表明,LS-2-3j能够显著提高ABCB1或ABCG2过表达多药耐药细胞对化疗药物的敏感性。进一步,我们通过流式细胞术检测了DOX和MITX在ABCB1过表达细胞K562/A02和ABCG2过表达细胞MCF-7/ABCG2中的累积和外排水平。结果显示,经LS-2-3j预处理后,DOX和MITX在K562/A02和MCF-7/ABCG2细胞中的累积量显著提高;同时,LS-2-3j能够显著抑制K562/A02及MCF-7/ABCG2细胞中DOX及MITX的外排。然而,LS-2-3j对亲本细胞K562及MCF-7并没有明显的促DOX和MITX累积和外排作用。然后,我们检测了LS-2-3j对ABCB 1及ABCG2蛋白ATP酶活性的抑制情况,发现LS-2-3j能够抑制两种蛋白ATP酶的活性。采用Western Blot及real-time PCR技术,我们也发现,LS-2-3j能够显著下调细胞内ABCB1及ABCG2 mRNA及蛋白的表达水平。综上所述,LS-2-3j作为一种合成的新结构吲哚类化合物,具有很强的体外逆转多药耐药作用。其机制是能够靶向和抑制ABCB1和ABCG2两种多药耐药泵的功能和表达。一方面,LS-2-3j能够抑制ABCB1和ABCG2蛋白ATP酶的活性,从而增加细胞内化疗药物的累积而增强多药耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。另一方面,LS-2-3j能够显著下调细胞内ABCB1及ABCG2的蛋白和mRNA表达水平。因此,LS-2-3j作为ABCB1和ABCG2的抑制剂具有逆转肿瘤细胞多药耐药的效果。所以本论文为临床抗多药耐药的治疗提供了理论和体外的实验基础,而LS-2-3j作为先导化合物,为逆转肿瘤多药耐药的药物研发和结构优化提供了实验依据。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R96
【部分图文】：

蛋白,多药耐药,化合物,灰度分析

图２．２?ＡＢＣＧ２蛋白在稳定转染细胞株ＭＣＦ－７／ＡＢＣＧ２、２９３Ｔ／ＡＢＣＧ２及其亲??本细胞中的表达水平。灰度分析结果以相对２９３Ｔ及ＭＣＦ－７对照组的倍数方式呈??现，ＧＡＰＤＨ为实验的内参蛋白。上述实验数据均重复三次取平均值（ｍｅａｎ?士?ＳＤ）〇??Ｐ值与２９３Ｔ或ＭＣＦ－７对照组比较所得，其中＞＜０．０５广ｐ＜０．０１广＞＜０．００１。??Ｆｉｇｕｒｅ?２．２?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＡＢＣＧ２?ｉｎ?ｔｈｅ?ｓｔａｂｌｙ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ＭＣＦ－７／ＡＢＣＧ２?ａｎｄ??２９３Ｔ／ＡＢＣＧ２?ｃｅｌｌｓ?ａｎｄ?ｔｈｅｉｒ?ｐａｒｅｎｔａｌ?ｃｅｌｌｓ．?Ｔｈｅ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ａｒｅ?ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ?ａｓ?ｆｏｌｄ?ｃｈａｎｇｅ?ｔｏ??ｔｈｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ?ｏｆ?２９３Ｔ?ｏｒ?ＭＣＦ－７．?ＧＡＰＤＨ?ｉｓ?ｔｈｅ?ｉｎｔｅｒｎａｌ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎ?ｔｈｅ??ｆｉｇｕｒｅ．?Ｅａｃｈ?ｂａｒ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?ｔｈｅ?ｍｅａｎ?±?ＳＤ?ｏｆ?ｔｈｒｅｅ?ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，?ｐ?＜??０．０５，?ｐ?＜?０．０１，?ｐ?＜?０．００１?ｖｓ．?ｔｈｅ?２９３Ｔ?ｏｒ?ＭＣＦ－７?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ．??２．?３．?２抗肿瘤多药耐药化合物的筛选??ＭＴＴ检测法是一种检测细胞增值或细胞存活的实验方法。化合物ＭＴＴ可以??

细胞毒性,化疗药物,过表达,细胞株

山东大学硕士学位论文??２．?３．?３?ＬＳ－２－３?ｊ的细胞毒性分析??本研宄采用ＭＴＴ法进一步检测了化合物ＬＳ－２－３ｊ对多药耐药细胞，化疗药??物敏感细胞及正常细胞的生长抑制率，进而得出ＬＳ－２－３ｊ对不同细胞的细胞毒性。??如图?２．３?所示，化合物?ＬＳ－２－３ｊ?对?ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－７／Ａｄｒ、ＭＣＦ－７／ＡＢＣＧ２、Ｋ５６２、??Ｋ５６２／Ａ０２、ＫＢ、ＫＢ／ＶＣＲ、２９３Ｔ、２９３Ｔ／ＡＢＣＧ２、ＢＥＡＳ／２Ｂ?和?Ｌ０２?等细胞的?ＩＣ５０??ｆ＾ｃ＾＾；３．１８８±０．１５３?ｎｍｏｌ／Ｌ，２．４３４±０．２０８?（ｊｍｏｌ／Ｌ＾４．０１９±０．１８９?＾ｍｏｌ／Ｌ，４．５８０±０．８８０??ｊｉｍｏｌ／Ｌ、４．８１４士０．４９４?ｐｍｏｌ／Ｌ、４．０５３±０．６８０?｜ｉｍｏｌ／Ｌ、２．７５８士０．２３０?｜ｉｍｏｌ／Ｌ、??７．３５５±０．３５７?｜＿ｕｎｏｌ／Ｌ、６．８００±０．７２３?｜ｉｍｏｌ／Ｌ、１０．８３５±０．２１５?ｐｍｏｌ／Ｌ、１２．１８３±０．２２４??Ｕｍｏｌ／Ｌ。如上所示，ＬＳ－２－３ｊ对正常细胞２９３Ｔ、ＢＥＡＳ／２Ｂ和Ｌ０２的细胞毒性要??低于肿瘤细胞，而对多药耐药细胞及其亲本细胞的细胞毒性相当。??

抑制细胞,累积量

从３．３．１实验结果中得知，ＬＳ－２－３ｊ能够明显提高抗癌药物在ＡＢＣＢ１和??ＡＢＣＧ２过表达耐药细胞内的积累量，因此本实验中，我们探讨了?ＬＳ－２－３Ｊ对化??疗药物外排的影响。如图３．２Ａ和Ｃ所示，在ＡＢＣＢ１过表达的多药耐药细胞??Ｋ５６２／Ａ０２中，ＤＯＸ在细胞内的累积量由１００％?（０?ｍｉｎ）降低到６２．３２９％?（１２０?ｍｉｎ）；??经ＬＳ－２－３ｊ预处理之后，累积量由１００％?（０?ｍｉｎ）降低到７５．１２１％?（１２０?ｍｉｎ），ＤＯＸ??的流出量明显减少。而在化疗药物敏感型亲本细胞Ｋ５６２中，ＤＯＸ在细胞内的??累积量仅由１００％?（０?ｍｉｎ）降低到８５．０７３％?（１２０?ｍｉｎ），其在细胞内的累积量高于??耐药细胞。同样如图３．２Ｂ和Ｄ所示，在ＡＢＣＧ２过表达的ＭＣＦ－７／ＡＢＣＧ２细胞??中，ＭＩＴＸ?在细胞内由?１００％?（０?ｍｉｎ）降低到?６１．３１４％?（１２０?ｍｉｎ）；经?ＬＳ－２－３ｊ?预处??理之后，ＭＩＴＸ的流出明显减少，细胞内积累量仅由１００％?（０?ｍｉｎ）降低到７０．２３９％??（１２０ｍｉｎ）。所以综上所述
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