α-溶血素纳米孔道阻滞剂的发现及分子机制研究

发布时间：2017-03-22 13:01

  本文关键词：α-溶血素纳米孔道阻滞剂的发现及分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：金黄色葡萄球菌是引起化脓性感染的常见革兰式阳性致病菌,可以引起一系列的疾病,如皮肤化脓感染、伤口感染、败血症、菌血症和坏死性肺炎等。目前常用的治疗方法是使用抗生素进行传统的杀菌治疗,由于细菌本身的进化和抗生素的滥用导致细菌对抗生素耐药性逐渐增强,使得针对金黄色葡萄球菌的治疗愈发困难。因此,针对毒力因子为靶标的治疗策略引起了大家的重视,抑制毒力因子逐渐成为治疗金黄色葡萄球菌感染重要策略之一。α-溶血素作为金黄色葡萄球菌致病的重要毒力因子,在细菌性疾病败血症的发病过程中起着重要的作用。α-溶血素由293个氨基酸组成,为33.2 kD的水溶性蛋白。它可以在细胞膜以及合成的磷脂双分子层中进行自我组装成七聚体,形成一个直径约1.5 nm的孔道,可以通透水、离子和小分子使红细胞溶解,导致败血症。体外实验显示阻滞纳米孔道,抑制它的通透性可以减少红细胞、血小板等的溶解,在金黄色葡萄球菌引发的动物疾病模型中有较好的疗效。因此,α-溶血素有望成为治疗金黄色葡萄球菌药物的新靶点。本文首先运用人工脂双层技术记录天然纳米通道α-溶血素的单通道电流,并研究了不同电压下通道特性,发现在-40 mV电压下α-溶血素的单通道电流稳定,故将其选为筛选化合物条件。在此电压下对一批天然化合物进行筛选,发现树脂糖苷SS-88能长时间的阻断α-溶血素孔道电流。不同于以前报道过的阻断剂,SS-88从两侧均可阻断α-溶血素孔道电流。进一步研究中发现SS-88可减少红细胞体外溶血,在急性血管内溶血的小鼠模型中可以阻滞α-溶血素溶解红细胞的效应,延长小鼠的存活时间和降低小鼠的死亡率。最后应用定点残基突变、蛋白纯化和人工脂双层技术对SS-88阻断α-溶血素孔道的分子机制进行初步研究。综上所述,本课题用人工脂双层方法筛选出α-溶血素纳米孔道阻滞剂SS-88,其可以阻滞α-溶血素孔道电流,并发现它可以减少α-溶血素导致的红细胞体外溶血,抑制动物血管内溶血,减少脏器损伤。另外,我们对SS-88阻断α-溶血素的分子机制也进行了初步研究,这为抗金黄色葡萄球菌所致的菌血症和败血症药物的研发提供了新的治疗策略。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 α-溶血素 溶血 纳米孔道 阻滞剂
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 第一章 引言9-18
• 1.1 概述9
• 1.2 金黄色葡萄球菌的耐药性9-11
• 1.3 α-溶血素形成纳米孔道11-14
• 1.4 以 α-溶血素为治疗靶点的药物研究进展14-17
• 1.5 立题依据17-18
• 第二章 实验材料与方法18-30
• 2.1 平面脂质双分子层技术平台的介绍18-21
• 2.1.1 平面脂质双分子层技术平台的概述18-19
• 2.1.2 平面脂质双分子层工作站构成19-21
• 2.2 实验材料21-23
• 2.2.1 实验试剂21-22
• 2.2.2 仪器设备22-23
• 2.3 实验方法23-30
• 2.3.1 平面脂质双分子层实验操作23-24
• 2.3.2 PCR及定点残基突变24-25
• 2.3.3 突变蛋白的表达与纯化25-27
• 2.3.4 体外溶血实验测定27-28
• 2.3.5 体内溶血实验28
• 2.3.6 血涂片,CBC和血液生化试验28
• 2.3.7 数据统计和处理28-30
• 第三章 实验结果30-52
• 3.1 α-溶血素孔道的电生理特性30-40
• 3.1.1 α-溶血素在不同电压下的电流特性30-31
• 3.1.2 α-溶血素电压依赖性机制初步研究31-39
• 3.1.3 小结39-40
• 3.2 α-溶血素纳米孔道阻滞剂的发现及分子机制研究40-52
• 3.2.1 化合物的筛选及SS-88的发现40-42
• 3.2.2 SS-88生物活性研究42-46
• 3.2.2.1 SS-88减少红细胞体外溶血43
• 3.2.2.2 SS-88提高小鼠存活率以及延长存活时间43-45
• 3.2.2.3 SS-88减少α-溶血素导致的血管内溶血，改善血生化指标45-46
• 3.2.3 SS-88分子机制研究46-51
• 3.2.3.1 β-CD不影响SS-88对于 α-溶血素的阻断效应47-48
• 3.2.3.2 SS-88对 α-溶血素阻断作用中关键氨基酸初步扫描48-51
• 3.2.4 小结51-52
• 第四章 研究总结和展望52-54
• 4.1 研究总结52-53
• 4.2 展望53-54
• 致谢54-55
• 参考文献55-60
• 攻读硕士期间所获研究成果及参加的学术会议60-61
• 综述 关于α-溶血素的药物研究概况61-76
• 参考文献71-76

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本文编号：261530