27nt miRNA对eNOS调节及HUVECs增殖相关因子AP-1作用机制研究

发布时间：2017-06-10 10:06

  本文关键词：27nt miRNA对eNOS调节及HUVECs增殖相关因子AP-1作用机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：前期工作发现,内皮型一氧化氮合酶第4内含子的27碱基重复子产生相应27nt miRNA,并对eNOS的转录和表达有负反馈调节作用。进一步探讨该内含子源性27nt miRNA对内皮型一氧化氮合酶基因调节的分子机制及脐静脉内皮细胞增殖相关转录因子AP-1的作用机制。1.明确27nt miRNA对内皮细胞表型的调控作用2.阐明27nt miRNA抑制内皮细胞增殖和转移的机制。3.旨在从新的角度阐明内皮细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制,为寻找新的心血管疾病治疗靶点提供理论依据。方法：1.体外观察27nt miRNA对内皮细胞生物学性状的影响：将人工合成的wt-27nt miRNA和mut-27nt miRNA mimics分别转染内皮细胞,观察内皮细胞的增殖(MTT法和细胞克隆法)、迁移(细胞划痕实验)、侵袭(Transwell实验)等生物学行为的变化。2.27nt miRNA下游靶基因的预测、验证和功能研究：我们使用TargetScan靶基因预测软件并分析相关因素,筛选27nt miRNA可能的下游靶基因AP-1。然后。应用荧光素酶报告系统验证27nt miRNA对AP-1的负性调控作用。进一步采用qRT-PCR、免疫组化和免疫印迹实验(western blotting)检测靶基因AP-1 mRNA和蛋白和eNOS mRNA和蛋白表达水平的改变。3.在VEGF生长因子刺激下,进一步采用qRT-PCR和免疫印迹实验(western blotting)检测共转染27nt miRNA和AP-1后eNOS mRNA和蛋白表达水平的改变,最后应用MTT法观察内皮细胞的增殖情况。结果：1.过表达27nt miRNA对内皮细胞的增殖和迁移以及侵袭具有显著的抑制作用,2.通过生物信息学的预测发现,AP-1可能是27nt miRNA的下游一个靶基因,荧光素酶报告表明,27nt miRNA对于它结合位点荧光报告基因活性具有显著抑制作用,但其对突变体和对照质粒的活性却没有显著性的影响。前期工作发现,eNOS不是27nt miRNA的预测靶基因,过表达27nt miRNA对eNOS mRNA以及蛋白表达水平有明显影响。以上研究证实27nt miRNA通过转录后水平负性调控AP-1参与内皮细胞的侵袭和转移。3.在VEGF的刺激下,共转染27nt miRNA和AP-1对eNOS mRNA和蛋白水平影响更为显著。结论：1.过表达27nt miRNA显著抑制内皮细胞增殖、迁移和侵袭能力,提示27nt miRNA在内皮细胞生物学功能方面扮演重要角色。2.过表达27nt miRNA显著抑制eNOS和AP-1蛋白表达,从而显著抑制内皮细胞的增殖,迁移,侵袭。3.在VEGF的刺激下,27nt miRNA和AP-1负调控eNOS mRNA和蛋白水平表达。
【关键词】：miRNA eNOS 内皮细胞 AP-1
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 个人简历3-6
• 主要中英文缩略语表6-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 引言12-16
• 第一部分 细胞培养、高表达质粒构建和细胞转染16-24
• 引言16
• 1 材料和仪器16-17
• 2 方法17-21
• 3 结果21-23
• 4 讨论23-24
• 第二部分 27nt miRNA对内皮细胞表型的影响24-33
• 引言24
• 1 材料和仪器24-25
• 2 方法25-27
• 3 结果27-31
• 4 讨论31-33
• 第三部分 27nt miRNA对内皮细胞生物学行为影响的分子机制33-49
• 引言33
• 1 材料和仪器33-34
• 2 方法34-41
• 3 结果41-47
• 4 讨论47-49
• 第四部分 27nt miRNA调节AP-1和eNOS协同参与内皮细胞生物学行为49-62
• 引言49
• 1 材料和仪器49-50
• 2 方法50-55
• 3 结果55-59
• 4 讨论59-62
• 小结62-63
• 参考文献63-71
• 综述71-112
• 参考文献98-112
• 致谢112-113
• 攻读学位期间发表论文113

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 徐昊,王明荣,颜光涛;脂质体转染技术进展及其应用[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;2000年06期

2 刘云海,钟英丽,任凯群,周建林,张健,韩梅;细胞转染条件的优化[J];湖南师范大学自然科学学报;2004年02期

3 黎健;;miR-34a调控内皮祖细胞介导的血管新生[J];中国动脉硬化杂志;2011年03期

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本文编号：438061