纺锤链霉菌SD-07与突变株所产抗生素特性比较及其胞外多糖的初步研究

发布时间：2017-06-11 23:11

  本文关键词：纺锤链霉菌SD-07与突变株所产抗生素特性比较及其胞外多糖的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：真菌感染在临床上波及范围广,常用的抗真菌药物有多烯大环内酯类、唑类、棘球白素类、丙烯胺类、嘧啶类,每种药物均存在一定的毒副作用,但研究发现多烯大环内酯类类相对于其它种类药物来说其毒副作用相对较低,同时也是临床上治疗真菌感染的最后用药。但长期大量使用同样具有导致肾功能衰竭和血栓性静脉炎的毒性,因此寻找更为低毒的抗生素显得尤为重要。纺锤链霉菌(Streptomycese netropsis) SD-07是本实验室2007年发现的一株新型菌株,其所产抗生素为多烯大环内酯类抗生素,相比两性霉素B,它具有更强的抗真菌活性。SD-07具有两种高产突变株163和180,为验证三种菌株经过5年传代后菌株是否仍高产,抗生素结构及活性是否有变化,本论文对三种菌株所产抗生素进行产量和活性的比较,同时对不同的纯化方法进行了活性、稳定性和毒性比较。本实验室在对链霉菌SD-07接合转移体系的建立过程中发现Ca2+能够极大地增加接合转移的频率,电镜下观察链霉菌SD-07菌体发现当Ca2+存在时其胞外多糖的产生量明显比不添加Ca2+时多。为更好的阐明胞外多糖与Ca2+以及接合转移之间的关系,本论文同时对SD-07胞外多糖的发酵和结构解析进行了相关研究。研究结果如下：1.抗生素相关研究结果纺锤链霉菌SD-07的180突变株是抗生素高产菌株,163菌株次之,相对于原始菌株SD-07,180抗生素产量是其3.33倍,163菌株是其1.28倍。高压液相(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)。液相-质谱分析(liquid chromatography-mass spectrum, LC-MS)和抑菌实验结果显示三种抗生素主要成分之间并无大的差别。不同的制备方法表明萃取法所制备的抗生素活性最为稳定,分子筛所制备的抗生素最不稳定。相隔三个月的抑菌性实验证明菌株180所产的抗生素粗品活性最高,随着时间的延长,抑菌活性增加,推测可能与溶解性有关。就细胞毒性试验来讲中压液相层析(Fast Pressure Liquid Chromatography, FPLC)是一种提纯抗生素、降低毒性并提高抑菌性的好方法。SOS/umu-1acZ体系的致突变性检测结果表明链霉菌所产生抗生素的体外致突变性为阴性,并与突变株类型和制备方法无关。2.胞外多糖相关研究结果胞外多糖产量最高时所用发酵时间为48h,培养基为R2YE,Ca2+对多糖的产生有明显的促进作用,Cu2+的抑制作用最为明显,K+、Na+多糖产生几乎没有影响,Mg2+、Fe3+、Mn2+低浓度时促进胞外多糖的产生。胞外粗多糖经过醇沉和sevege法除蛋白后,随后经过DEAE纤维素阴离子交换柱及分子筛凝胶SephadexG-75分离得到纯化多糖。多角度激光光散射仪分析得知多糖主要成分平均分子量约为32.29kDa。单糖组分分析表明,SD-07的胞外多糖由Fuc(岩藻糖)、Gal(半乳糖)、Glc(葡萄糖)和Man(甘露糖)组成,其中Fuc:Gal:Glc:Man=1.33:1.00:8.67:27.33。红外光谱分析(Infrared Spectra Analysis, FTIR)结果证明多糖中含有甘露糖和葡萄糖,并且其构型为p-D-葡萄糖和p-D-甘露糖。本论文研究结果：筛选出稳定高产高活性菌株180,其抗生素组分及抑菌活性等性质与原始菌株SD-07无显著差异,提示180是未来抗生素生产的合适菌株。胞外多糖的产量与Ca2+的存在有关系,结构解析结果为接合转移和胞外多糖之间的关系提供了可靠数据。
【关键词】：抗生素 制备 特性比较 胞外多糖 结构分析
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R914
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 第一章 前言12-26
• 1.1 研究背景及意义12-13
• 1.2 多烯大环内酯类抗生素13-18
• 1.2.1 作用机理14-15
• 1.2.2 抗生素制备15-18
• 1.2.2.1 结晶法16
• 1.2.2.2 色谱法16-17
• 1.2.2.3 溶剂萃取法17-18
• 1.2.2.4 离子交换法18
• 1.2.2.5 吸附法18
• 1.3 微生物胞外多糖18-24
• 1.3.1 微生物胞外多糖的应用18-20
• 1.3.1.1 药学领域19
• 1.3.1.2 农业19-20
• 1.3.1.3 食品领域20
• 1.3.1.4 石油、化工20
• 1.3.2 多糖的结构解析方法20-22
• 1.3.2.1 酸水解21
• 1.3.2.2 色谱法21
• 1.3.2.3 甲基化21-22
• 1.3.2.4 红外光谱22
• 1.3.2.5 核磁共振(NMR)22
• 1.3.3 胞外多糖产生的影响因素22-23
• 1.3.4 SD-07胞外多糖与接合转移之间的关系23-24
• 1.4 本论文主要内容及研究价值24-26
• 第二章 纺锤链霉菌SD-07及其突变株所产抗生素特性比较26-52
• 2.1 实验材料26-29
• 2.1.1 菌种26
• 2.1.2 培养基26-28
• 2.1.3 实验仪器28
• 2.1.4 试剂28-29
• 2.2 实验方法29-34
• 2.2.1 三种抗生素的提取与回收率29
• 2.2.2 三种抗生素的中压液相分析29
• 2.2.3 三种抗生素的组分分析29-30
• 2.2.3.1 HPLC分析三种抗生素29-30
• 2.2.3.2 质谱分析三种抗生素30
• 2.2.4 三种抗生素的抑菌活性30-31
• 2.2.5 三种制备方法制备抗生素31
• 2.2.5.1 中压液相制备抗生素31
• 2.2.5.2 Sephadex LH-20制备抗生素31
• 2.2.5.3 正丁醇萃取制备抗生素31
• 2.2.6 三种方法所制备抗生素对人体内两种致病真菌的抑制作用31-32
• 2.2.7 三种方法所制备抗生素的细胞毒性比较32
• 2.2.8 三种方法所制备抗生素的致突变性比较32-33
• 2.2.9 菌种筛选与保存33-34
• 2.3 结果与讨论34-50
• 2.3.1 三种抗生素的提取与得率34-35
• 2.3.2 三种抗生素的中压液相分析35-36
• 2.3.3 三种抗生素的组分分析36-40
• 2.3.3.1 三种抗生素的高效液相分析36-39
• 2.3.3.2 三种抗生素的质谱分析39-40
• 2.3.4 三种抗生素的抑菌活性结果比较40
• 2.3.5 三种方法所制备抗生素40-43
• 2.3.5.1 MPLC制备抗生素41
• 2.3.5.2 Sephadex LH-20制备抗生素41-42
• 2.3.5.3 正丁醇萃取制备抗生素42-43
• 2.3.6 三种方法所制备抗生素对人体内两种致病真菌的抑制作用43-45
• 2.3.7 三种方法所制备抗生素的细胞毒性比较45-47
• 2.3.8 三种方法所制备抗生素的致突变性比较47-49
• 2.3.9 菌种的筛选与保存49-50
• 2.4 本章总结50-52
• 第三章 纺锤链霉菌SD-07所产胞外多糖的特性研究及结构解析52-80
• 3.1 实验材料52-56
• 3.1.1 菌种52
• 3.1.2 培养基52-55
• 3.1.3 实验仪器55
• 3.1.4 试剂与凝胶55-56
• 3.2 实验方法56-60
• 3.2.1 苯酚-硫酸法[74]测定胞外多糖含量56-57
• 3.2.2 筛选多糖发酵时间57
• 3.2.3 不同阳离子对多糖产量的影响57
• 3.2.4 筛选多糖发酵用培养基57-58
• 3.2.5 上清与菌体中多糖含量对比58
• 3.2.6 提取后表面多糖的除杂和分离纯化58-59
• 3.2.7 纯化后多糖分子量的测定59
• 3.2.8 纯化后胞外多糖的酸解[77]及组分测定59
• 3.2.9 纯化后多糖的红外光谱分析59-60
• 3.3 结果与讨论60-77
• 3.3.1 胞外多糖(EPS)测定方法的建立60
• 3.3.2 EPS产生的影响因素60-64
• 3.3.2.1 培养时间对EPS的影响60-61
• 3.3.2.2 金属离子对EPS的影响61-63
• 3.3.2.3 培养基对EPS的影响63-64
• 3.3.3 EPS的制备64-68
• 3.3.3.1 发酵上清液与菌体多糖含量比较64-65
• 3.3.3.2 胞外多糖的分离纯化65-68
• 3.3.4 EPS结构解析(表征)68-77
• 3.3.4.1 多糖分子量的测定68-69
• 3.3.4.2 胞外多糖单糖组成分析69-73
• 3.3.4.3 红外光谱分析结果73-74
• 3.3.4.4 NMR结果74-77
• 3.4 本章总结77-80
• 全文总结80-82
• 参考文献82-90
• 致谢90-91
• 学位论文评阅及答辩情况表91

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