雷公藤红素与汉黄芩素联合应用对肿瘤细胞能量代谢的影响

发布时间：2017-06-24 15:09

  本文关键词：雷公藤红素与汉黄芩素联合应用对肿瘤细胞能量代谢的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着科技的不断进步,人类的生存环境污染日益加剧,癌症己成为威胁人类生存的首要因素。癌症治疗的主要手段有放、化疗及手术切除,这些治疗方法对于人体正常细胞均有一定程度的影响。近年来传统中药对于肿瘤防治作用得到了研究者的广泛关注。雷公藤红素与汉黄芩素为中药有效活性成分,两者均有抗癌、抗炎、抗病毒和抑菌等作用。但由于雷公藤红素的细胞毒作用较强,汉黄芩素给药剂量较高,影响了两种药物在临床上的应用。本课题采取雷公藤红素和汉黄芩素联合给药的方法来降低细胞毒作用,减少给药剂量,提高抗肿瘤活性。目的：通过研究雷公藤红素(Celastrol)和汉黄芩素(Wogonin)单独用药和联合应用对三种细胞—人脐静脉内皮细胞(ECV304)、人胃癌细胞(SGC-7901)和人肺癌细胞(A549)增殖活性及能量代谢的影响,表明联合用药较单独用药能更好地降低细胞毒作用,减少给药剂量,提高抗肿瘤活性。方法：1.采用MTT法测定对肿瘤细胞和内皮细胞的抑制率；2.细胞计数法绘制生长曲线判定对肿瘤细胞和内皮细胞的生长趋势的影响；3.采用HE染色法观察对肿瘤细胞和内皮细胞的形态变化；4.采用分光光度法测定肿瘤细胞和内皮细胞内糖酵解途径中的限速酶类己糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶,三羧酸循环中的标志酶琥珀酸脱氢酶及能量代谢终产物ATP含量水平；5.采用Western blot法分析细胞内低氧诱导因子(HIF-1α)和单羧基转运体(MCF-4)表达水平。结果：1.通过MTT结果确定最佳联合给药浓度,分别为汉黄芩素15gg·mL-1,雷公藤红素3μg.mL-1；2.HE染色和生长曲线结果表明联合给药组较单独用药组对SGC-7901、ECV304增殖抑制显著、形态变化明显,尤以SGC-7901作用最强,表现为细胞变圆,体积缩小,核深染,胞质凝集和颜色变深,细胞浓度显著降低。对A549的增殖抑制作用较弱。3.细胞的生长与增殖离不开能量的供给,肿瘤细胞由于低氧微环境的诱导作用,糖酵解供能途径起主导作用,实验中检测了糖酵解途径中的酶类包括己糖激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶的含量变化。结果显示联合用药对三种不同细胞的酶活性抑制强度不同,对己糖激酶活力抑制率在人脐静脉上皮细胞(ECV304)和人胃癌细胞(SGC-7901)较高,在人肺癌细胞(A549)无明显变化,联合用药对三种细胞的丙酮酸激酶活力均无影响。乳酸脱氢酶活力测定结果显示联合用药明显降低了三种细胞乳酸脱氢酶的活力,提示肿瘤细胞的酸性微环境被改变其增殖将被抑制。琥珀酸脱氢酶是线粒体的标志性酶,检测结果表明联合用药对SGC-7901内琥珀酸脱氢酶抑制作用显著,对ECV304次之,对A549不明显。ATP是细胞能量的主要供给者,联合用药能够显著降低ECV304和SGC-7901中ATP含量。4.低氧诱导因子1α (HIF-1α)是细胞增殖和糖酵解途径调节的重要蛋白,单羧基转运体(MCT-4)是将乳酸分泌到细胞外,维持细胞酸性微环境的主要蛋白,联合给药能显著降低SGC-7901和ECV304细胞内HIF-1α和MCT-4表达水平,而对A549细胞中两种蛋白的表达影响较小。结论：雷公藤红素与汉黄芩素联合用药较单独用药能明显降低人胃癌细胞SGC-7901和人脐静脉内皮细胞ECV304中HIF-1α和MCT-4表达水平,干扰能量代谢,抑制糖酵解途径中己糖激酶和乳酸脱氢酶和氧化磷酸化中的琥珀酸脱氢酶的活性,降低ATP的含量,达到抑制人胃癌细胞SGC-7901和人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的作用,而对A549的作用不显著。说明联合用药对人胃癌细胞SGC-7901作用较强,对人脐静脉内皮细胞ECV304有一定的影响,可抑制胃癌细胞增殖和肿瘤血管生成。
【关键词】：雷公藤红素 汉黄芩素 癌细胞 酶 能量代谢 ATP
【学位授予单位】：哈尔滨商业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 1 绪论12-18
• 1.1 雷公藤红素的研究进展12-15
• 1.1.1 雷公藤红素诱导肿瘤细胞凋亡12-13
• 1.1.2 雷公藤红素影响肿瘤细胞周期13-14
• 1.1.3 雷公藤红素抑制血管生成14
• 1.1.4 雷公藤红素抑制肿瘤细胞侵袭与转移14-15
• 1.1.5 其他15
• 1.2 汉黄芩素的研究进展15-16
• 1.2.1 汉黄芩素促进肿瘤细胞的凋亡15
• 1.2.2 汉黄芩素抑制肿瘤血管生成与转移15-16
• 1.2.3 汉黄芩素逆转肿瘤细胞的耐药性及促癌细胞分化16
• 1.2.4 其他16
• 1.3 肿瘤的能量代谢16-18
• 2 雷公藤红素与汉黄芩素体外联合抗肿瘤活性研究18-29
• 2.1 引言18
• 2.2 材料与仪器18-20
• 2.2.1 细胞株18
• 2.2.2 试剂18-19
• 2.2.3 仪器19
• 2.2.4 试剂配制19
• 2.2.5 细胞培养19-20
• 2.3 MTT法选择联合用药中雷公藤红素和汉黄芩素剂量20
• 2.4 MTT法测定细胞存活率20
• 2.5 生长曲线法绘制细胞增殖曲线20-21
• 2.6 HE染色观察细胞形态变化21
• 2.7 统计与分析21
• 2.8 结果与分析21-28
• 2.8.1 联合用药中汉黄芩素、雷公藤红素剂量选择21-23
• 2.8.2 MTT法测定联合用药对细胞增殖活性的影响23-24
• 2.8.3 生长曲线法绘制增殖曲线24-25
• 2.8.4 HE染色法观察细胞形态学变化25-28
• 2.9 小结28-29
• 3 雷公藤红素与汉黄芩素联合对肿瘤细胞能量代谢的影响29-43
• 3.1 引言29
• 3.2 材料与仪器29-30
• 3.2.1 细胞株29
• 3.2.2 试剂29
• 3.2.3 仪器29-30
• 3.3 样品干预与处理30
• 3.3.1 细胞干预与收集30
• 3.3.2 样品的处理30
• 3.4 细胞蛋白浓度测定30-31
• 3.5 糖酵解途径酶活力测定31-32
• 3.5.1 糖激酶(HK)活力测定31
• 3.5.2 丙酮酸激酶(PK)活力测定31-32
• 3.5.3 乳酸酸脱氢酶(LDH)活力测定32
• 3.6 氧化磷酸化酶-琥珀酸脱氢酶(SDH)活力测定32-33
• 3.7 糖代谢产物-三磷酸腺昔(ATP)含量测定33-34
• 3.8 结果与分析34-41
• 3.8.1 蛋白浓度测定34
• 3.8.2 糖激酶活力34-35
• 3.8.3 丙酮酸激酶活力35-37
• 3.8.4 乳酸脱氢酶活力37-38
• 3.8.5 琥珀酸脱氢酶活力38-39
• 3.8.6 细胞内ATP含量39-41
• 3.9 小结41-43
• 4 联合用药对肿瘤细胞能量代谢影响的机制研究43-50
• 4.1 引言43
• 4.2 仪器与材料43-45
• 4.2.1 细胞株43
• 4.2.2 试剂43-44
• 4.2.3 仪器44
• 4.2.4 试剂配制44-45
• 4.3 蛋白收集与定量45
• 4.3.1 蛋白的收集45
• 4.3.2 蛋白定量45
• 4.4 Western-Blot检测细胞中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和单羧基转运体(MCT-4)45-46
• 4.4.1 蛋白电泳45-46
• 4.4.2 转膜46
• 4.4.3 抗体孵育46
• 4.4.4 影与扫描46
• 4.5 结果与分析46-49
• 4.5.1 蛋白定量46
• 4.5.2 低氧诱导因子和单羧基转运体的表达变化46-49
• 4.6 小结49-50
• 讨论50-54
• 结论54-55
• 参考文献55-61
• 攻读学位期间发表的学术论文61-62
• 致谢62

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