Cuevaenes的生物合成研究与结构改造及ansatrienins后修饰研究

发布时间：2017-07-14 03:22

  本文关键词：Cuevaenes的生物合成研究与结构改造及ansatrienins后修饰研究

  更多相关文章： cuevaenes 安莎霉素 ansatrienins FAD-binding单加氧酶 组合生物合成

【摘要】：Cuevaenes是一类以独特的3-羟基苯甲酸(3-hydroxybenzoic acid,3-HBA)为起始单元,由I型聚酮合酶(Polyketide Synthase, PKS)合成的线性多烯化合物,具有良好的抗菌和抗肿瘤活性。前期,本实验室从Streptomyces sp. LZ35中分离获得了一系列cuevaene类化合物,并通过体内外实验定位了其生物合成基因簇,明确了分支酸水解酶Cuv10负责起始单元合成,但是其聚酮后修饰过程尚未解析。为此,本论文对cuevaenes生物合成基因簇中5个可能参与其后修饰的基因展开了研究。通过对这5个基因的敲除和回补实验,我们发现cmv9、cuv18和cuvl9为cuevaenes合成的必需基因,而cuv21和cuv23基因的敲除不影响cuevaenes的合成。其中Cuv18与安莎合成途径中的保守的羟基化酶高度相似,推测其可能在聚酮链延伸过程中对3-HBA进行羟基化修饰。因此,我们尝试在体外将Cuv18与ACP形式的底物反应,但未能获得预期产物。此外,为了进一步阐明Cuv10独特的催化机理,我们开展了Cuv10的结构生物学研究,通过点突变实验推测了可能的催化活性位点,遗憾的是最终未能获得Cuv10的高分辨衍射结果。同时,鉴于cuevaenes与安莎霉素的合成起始单元(3-氨基5-羟基苯甲酸,AHBA)结构及其加载结构域相似,我们开展了cuevaenes的结构改造,通过将其起始单元加载结构域替换为格尔德霉素的相应序列,发现了一系列可能以AHBA为起始单元的cuevaenes类似物,仍有待目标产物分离及结构鉴定。安莎三烯(ansatrienins)是以AHBA为起始单元由I型聚酮合酶合成的安莎霉素类化合物,具有抗真菌和抗肿瘤活性。前期,本实验室从Streptomyces sp. XZQH13的LAL调控基因组成型表达突变株中分离获得了安莎三烯类化合物,并开展了部分O-(N-环己甲酰)-D-丙氨酰基侧链加载机制研究。本论文进一步通过PKS基因的敲除、astC和astFl基因的回补、AstC的点突变阐明了安莎三烯的丙氨酰化机制。另一方面,我们开展了起始单元AHBA羟基对位的羟基化研究,发现cuvl8同源基因astF2基因的敲除终止了安莎三烯的产生,积累了中间产物trienomycin A和trienomycin G,提示AstF2负责AHBA羟基对位的羟基化修饰；遗憾的是,尽管进行了多方面的尝试,AstF2的体外功能研究未能取得成功。综上所述,本论文发现了多个可能参与cuevaenes后修饰反应的必需基因,并通过组合生物合成制造了可能的cuevaenes衍生物／线性安莎中间体,是通过结构改造获得新安莎的有益尝试。此外,通过体内外实验阐明了ansatrienins的丙氨酰化机制,通过体内实验明确了AstF2的羟基化酶功能,为后续安莎霉素的合成生物学改造提供了新的功能元件。
【关键词】：cuevaenes 安莎霉素 ansatrienins FAD-binding单加氧酶 组合生物合成
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R914;Q78
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 符号说明及缩写词10-12
• 第1章 文献综述12-18
• 1.1 Cuevaenes类化合物的生物合成研究12-14
• 1.2 安莎霉素中AHBA的羟基化修饰研究14-16
• 1.3 本学位论文开展思路和研究内容16-18
• 第2章 链霉菌LZ35中cuevaenes的生物合成研究和结构改造18-66
• 2.1 引言18-19
• 2.2 实验材料19-24
• 2.2.1 菌株与质粒19
• 2.2.2 培养基19-20
• 2.2.3 试剂配制20-23
• 2.2.4 仪器设备23-24
• 2.3 实验方法24-33
• 2.3.1 后修饰基因敲除质粒的构建24-26
• 2.3.2 敲除基因回补质粒的构建26-27
• 2.3.3 大肠杆菌与链霉菌间的接合转移27-28
• 2.3.4 链霉菌基因组DNA的提取28
• 2.3.5 突变株的验证与发酵产物的HPLC检测28-29
• 2.3.6 蛋白的诱导表达29
• 2.3.7 考马斯亮蓝染色胶内酶解蛋白29-30
• 2.3.8 蛋白的分离纯化30-31
• 2.3.9 Cuv10蛋白结晶条件的筛选和优化31-32
• 2.3.10 Cuv10蛋白点突变的构建32
• 2.3.11 加载结构域的替换32-33
• 2.4 结果与讨论33-63
• 2.4.1 Cuevaenes后修饰基因的功能验证33-38
• 2.4.1.1 五个后修饰基因的敲除33-36
• 2.4.1.2 三个后修饰基因突变株的基因回补36-38
• 2.4.2 Cuv18的羟基化功能验证38-50
• 2.4.2.1 Cuv18敲除株的体内底物饲喂38-40
• 2.4.2.2 Cuv18与ACP形式底物的体外三步反应40-41
• 2.4.2.3 CoA形式底物的构建41-43
• 2.4.2.4 ACP形式底物的构建43-47
• 2.4.2.5 Cuv18与ACP形式底物的体外催化47-50
• 2.4.3 分支酸水解酶Cuv10的催化机制研究50-58
• 2.4.3.1 Cuv10蛋白的分离纯化50-51
• 2.4.3.2 Cuv10突变体构建与酶活检测51-53
• 2.4.3.3 Cuv10蛋白的结晶与优化53-55
• 2.4.3.4 Cuv10稳定条件筛选55-58
• 2.4.4 Cuevaenes的结构改造58-63
• 2.4.4.1 Cuevaenes的加载结构域替换58-61
• 2.4.4.2 加载结构域替换株中cuevaenes合成的阻断61-62
• 2.4.4.3 加载结构域突变株差异产物的提取条件摸索62-63
• 2.5 总结与展望63-66
• 第3章 链霉菌XZQH13中ansatrienins后修饰基因功能研究66-80
• 3.1 引言66
• 3.2 实验材料66-67
• 3.2.1 菌株、质粒与培养基66-67
• 3.2.2 试剂与仪器67
• 3.3 实验方法67-70
• 3.3.1 后修饰基因astF2和PKS的敲除67
• 3.3.2 后修饰基因的回补67-68
• 3.3.3 AstC突变体的构建68
• 3.3.4 AstF2突变株差异产物分离与鉴定68-69
• 3.3.5 链霉菌细胞总蛋白的制备69
• 3.3.6 XZQH13OE中高表达AstF2蛋白69-70
• 3.4 结果与讨论70-78
• 3.4.1 AStD1的敲除及astC和astF1敲除株的回补70-72
• 3.4.2 AstC的体外功能研究72-74
• 3.4.3 AstF2的功能研究74-78
• 3.4.3.1 AstF2基因的敲除和回补74-75
• 3.4.3.2 AstF2突变株差异产物的分离鉴定75-76
• 3.4.3.3 AstF2的体外酶活76-78
• 3.5 总结与展望78-80
• 附录80-84
• 参考文献84-88
• 致谢88-90
• 攻读学位期间发表的学术论文目录90-91
• 学位论文评阅及答辩情况表91

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本文编号：539489