盐酸椒苯酮胺代谢产物M6的合成及药代动力学研究

发布时间：2017-07-18 02:19

  本文关键词：盐酸椒苯酮胺代谢产物M6的合成及药代动力学研究

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【摘要】：研究背景钙增敏剂作为增加钙敏感性为主的正性肌力药,兼具强心和扩血管作用,其强心作用主要通过增加心肌收缩蛋白对Ca2+的敏感性,而较少增加细胞内[Ca2+],从而减少心律失常、避免Ca2+超载等副作用。钙增敏剂的发现为心力衰竭疾病的治疗提供了一个新途径,开创了抗心力衰竭药物研究的新领域。关于钙离子增敏剂的临床前研究较少,目前仅有芬兰Orion公司的levosimendan主要应用于常规疗法效果欠佳的急、慢性心衰上,钙离子增敏剂的开发和研究可进一步促进基础研究者了解钙离子增敏机制,同时为探索增敏剂应用于治疗心力衰竭或其他临床缺血性疾病治疗提供重要的参考依据。盐酸椒苯酮胺(Piperphentonamine hydrochloride,PPTA)是我国原始创新的钙增敏剂类化合物,已获多项国内外发明专利授权。实验表明PPTA可增加肌钙蛋白与Ca2+的亲和力、抗心肌缺血/再灌注损伤及Ca2+超载、开放钙敏感的钾通道、促进Na*通道失活等作用。近期发现PPTA可保护全脑缺血/再灌注损伤大鼠、保护OGD致损伤PC-12细胞,结果表明,PPTA可减低OGD致损伤PC-12细胞LDH、iNOS、bax/bcl-2比值及caspase-3表达,表现为抗凋亡、抗过氧化特征。预实验发现,PPTA在体内可代谢成多种活性物质,其中M6作为盐酸椒苯酮胺的主要代谢产物之一,其分子结构尚未验证,对于M6的活性代谢产物的具体临床前研究尚无开展,包括其合成路线,药物药代动力学及药效学研究等,M6的进一步研究探索可为PPTA的开发及临床应用提供新的考虑。本课题立足于M6的合成路线设计,结构验证,药代动力学及初步细胞药效展开,以期望开发M6新的作用靶点,探索M6保护体内重要器官的新方向。本实验分为五个部分,第一部分旨在设计及合成M6路线,通过质谱核磁分析确证M6的结构,为更了解M6与PPTA在结构中的差异。第二部分采用HPLC-UV测定方法生物样品内M6的含量,通过寻找合适内标物、合理的流动相比例及成分及波长检测等,成功建立了稳定、简便、快速的含量测定方法,用于研究M6在血浆样品及器官组织中浓度检测。第三部分进行高中低浓度剂量M6在大鼠中血浆药代动力学研究,同时高浓度剂量尾静脉注射M6,检测M6在组织器官中分布,研究M6在大鼠体内的分布特点。第四部分旨在研究M6在人、大鼠、猪血浆蛋白结合率,通过检测M6在血浆中游离浓度,评估各种属中的血浆蛋白结合率。第五部分通过培养PC-12细胞、原代新生乳鼠心肌细胞及神经元细胞,制备OGD损伤(氧糖剥夺试验损伤)模型模拟在机体内缺血缺氧的条件,对各类细胞产生损伤,CCK8法检测损伤条件后恢复高糖,氧气环境后,各类细胞的生长状态,为研究M6是否有机会应用在心肌缺血再灌注损伤或大脑缺血再灌注损伤提供参考,以期开发出有效的对缺血再灌注损伤具有保护性作用的新药。第一部分盐酸椒苯酮胺代谢产物M6的合成及鉴定研究实验目的建立合理的、科学的M6合成路线,通过质谱核磁分析并确证M6分子结构,对比原药PPTA的结构差异实验方法甲醇溶解PPTA后,加入一定量Pd-C,Ph2S。室温25℃常压反应约7小时后,加热浓缩溶剂至200mL,放置结晶后,取母液至于冰水浴条件下,分批加入硼氢化钠,加入饱和的碳酸氢钠水溶液,400mL乙酸乙酯,搅拌三十分钟,并用400mmL乙酸乙酯再萃取一次,无水硫酸钠干燥,得黄色油状物,加入适量盐酸乙醇溶液,刮擦得固体；加入95%7,醇溶解过滤,用甲醇加热使其溶解。放入冰箱5小时后过滤,得湿重样品。重复操作,得目标产物对照品。分别取目标产物进行质谱核磁分析。实验结果过渡体M1核磁共振氢谱数据：1H NMRδ:2.66-2.78 (m,7H),2.94 (t, J=8.4 Hz,2H),3.04 (t, J=7.2Hz,2H),3.19-3.22 (m,3H),3.32-3.35 (m, 1H),5.98 (s,2H),6.67(d, J=8.8 Hz,2H),6.74(dd, J=1.6,8. OHz,1H), 6.89(d, J=8.0 Hz,1H),6.90(d, J=1.6 Hz,1H),6.98(d, J=8.8 Hz, 2H),9.23(s,1 H),10.80 (s,1 H).过渡体M1核磁共振碳谱数据：13C NMR δ:28.03,29.07,36.10,43.88, 49.60,55.89,100.86,108.34,109.13,115.10,121.79,129.00,130.61, 130.81,146.01,147.38,155.52,206.73.过渡体M1质谱数据：ESI-MS:m/z 356.2[M+H]+; HRESI-MS: C21H25NO4+H ([M+H]+)实测值为356.1858。M6核磁共振氢谱数据：1H NMRδ:1.57-1.63(m,1H),1.73(m,1H), 1.85(m,1H),2.44-2.60 (m,3H),2.75(s,3H),2.95 (t, J=8.4 Hz,2H), 3.16-3.23(m,4H),3.48(s,1H),4.86(s,1H),5.98 (s,2H),6.67(d, J= 8.4 Hz,2H),6.74 (dd, J=1.6,8.0 Hz,1H),6.86 (d, J=7.6 Hz,1H),6.90 (d, J=1.6Hz,1H),6.98(d, J=8.4 Hz,2H),9.18(s,1 H),10.56(s,1 H).M6核磁共振碳谱数据：13C NMRδ:29.08,30.40,30.65,52.69,100.85, 108.33,109.12,115.04,121.78,129.03,130.68,132.05,145.99,147.38, 155.28.M6质谱数据：ESI-MS:m/z 358.2[M+H]+; HRESI-MS:C21H27NO4+ H([M+H]+)实测值为358.2019。结论确证所得M6目标分子结构为5-{(3,4-亚甲二氧基苯乙基)甲氨基}-1-对羟基苯基-戊烷-3-羟基盐酸盐。化学结构式显示,PPTA与M6在结构上差异在于烯基还原位置,PPTA为烯酮基,呈一定非极性,PPTA结构中烯酮基还原为酮基后,为过渡体M1化学结构,进一步还原后为代谢最终产物M6。预试验显示,M1与M6溶解性能较PPTA好,易溶于水,化学稳定性较PPTA好。第二部分M6在生物样品中HPLC-UV含量测定方法的建立实验目的建立有效、稳定、快速简便的HPLC-UV检测方法测定M6在生物样品中含量实验方法血浆及组织匀浆物含测定采用内标法,选用苯磺酸氨氯地平作为内标,色谱条件为：ODSC18色谱柱(waters,4.6×150mm,5μm),流动相为1%乙酸水：乙腈(86：14),流速1.0 mL·min-1,柱温40℃,进样量20μL,M6紫外检测波长为265 nm。生物样品预处理采用,5%冰乙酸的乙酸乙酯液液萃取法,40℃恒速氮气吹干法,流动相溶解振荡,高速离心取上清液20μLHPLC进样分析。实验结果方法学验证显示,内标参考物氨氯地平不干扰M6测定,具有良好的专属性。线性回归结果显示,M6标准曲线方程公式Y=0.0023X-0.0007(R2=0.9999),样品在在3.125-200μg·mL-1线性关系良好。精密度试验M6在日内精密度RSD分别为3.22%,3.75%,1.40% (n=5),在3d内测得日间精密度RSD分别为5.08%,5.29%,4.46%,表明该仪器精密度良好。重复试验表明M6重复试验RSD分别为6.53%,1.84%,1.61%,重复性8%,表明该方法重复性良好。M6生物样品回收率分别为92.18±2.04(%),89.50±0.35(%),89.92±1.49(%),回收率80%,符合测定要求。M6稳定性实验显示,M6样品分别在反复冻融3次、-4℃贮存12 h、室温25℃放置12h后,进样分析,高质量浓度200μg·mL-1的RSD分别为1.75%,2.64%,3.40%,中质量浓度25μg·mL-1的RSD分别在2.52%,2.83%,7.50%,低质量浓度3.125μg·mL-1的RSD分别在6.36%,6.48%,7.87%(n=5),符合方法学要求。结论含量检测方法简便、准确、干扰相对较少,灵敏度高,满足M6在生物样品含量检测方法标准。第三部分M6在SD大鼠中药代动力学的初步研究实验目的观察尾静脉注射条件下高中低剂量M6在大鼠血浆药代动力学及组织器官分布特点。实验方法M6血浆药代动力学给药方案：SD大鼠18只分成3组,高、中、低剂量组,分别16mg·kg-1、12mg·kg-1、8mg·kg-1、,每组6只,雌雄各半;尾静脉注射M6,分别在给药前和给药后1 min,3 min,5 min,10 min,15 min,30 min, 1 h,2 h,4 h,6 h,8 h内取样分析,计算血浆浓度,使用origin 8.0绘制血药浓度-时间曲线,实验结果采用PKsolver数据处理软件计算其药代动力学参数。M6大鼠体内组织分布给药方案：SD大鼠36只(200±50 g),随机分成6组,为1min取样组,10min取样组,30min取样组,1h取样组,2h取样组,4h取样组,每组6只,雌雄各半。按16mg·kg-1、剂量进行尾静脉注射后计时, 于1min, 10min,30min, 1h,2h,4h后,采集足量全血,并迅速解剖分离以下器官,心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,全胃,睾丸/卵巢,腹部肌肉,大肠,全脑,各组取样须具有一致性及合理性,同时剔除器官表面脂肪,用生理盐水冲去各器官表面残留血污,滤纸吸干,并于-70℃保存。各组织样品按实际称取重量,按质量体积比1：1.5加入生理盐水,制成组织匀浆液。匀浆液采用4℃、4000rpm/min,离心7min,按上述血浆处理方法后,进行HPLC测定,计算血浆浓度,使用Microsoft Excel 2007对数据进行初步处理。实验结果SD大鼠尾静脉注射M6高中低剂量后动力学过程符合非房室模型,血浆药代动力学结果显示SD大鼠尾静脉注射M6后,血药浓度-时间曲线呈双峰现象,高、中、低剂量的药代参数如下,AUC0-t分别为133.4±135.39、100.15±32.67、 77.49±70.43 mg·L-1·min(p0.05),Cmax分别2.52±0.86、2.63±1.07、1.94 ±0.99mg·L-1;消除率CL分别为0.12±0.06、0.08±0.01、0.08±0.03L·min-1; tmax分别为3.43±3.26、2.6±0.89、7.67±5.75min;MRT分别为85.99±44.24、 81.13±26.57、67.81±20.19min;t1/2分别为54.09±22.21、57.04±21.09。 44.94±15.43min。M6在大鼠内的组织分布特点较为集中,多数集中在肝脏与脾脏,浓度成极峰现象,组织分布结果反映出M6尾静脉注射1min后,浓度依次为肾脏心肺脾大肠脑血浆肝脏胃卵巢或睾丸肌肉,M6脑部浓度达7.23± 0.19μg/ml,显示M6具有一定的血脑屏障通透力;10min后M6组织浓度富集为卵巢或睾丸肺大肠脾肾脏肝脑血浆胃心肌肉,其中卵巢或睾丸检测差异大,M6卵巢浓度高于睾丸浓度,这可能意味着M6具有性别差异,其中M6脑浓度此刻最高,达8.3±2.91μg/ml;30min后,M6分别高度集中于肝脏,脾,胃,均大于100μg/ml,远高于其他器官组织,其中脾脏最高,M6具有一定脾脏选择性,30min后,各器官均逐渐减少。结论M6在体内的消除率CL随着剂量增大表现增高,高剂量注射组MRT为85.994±44.24mmin,均高于中、低剂量组,平均滞留时间与剂量成正相关,由于M6与PPTA存在结构性的区别,使得M6在PPTA血浆代谢与组织器官分布存在明显的区别。实验亦显示M6在选择上表现对脾脏的选择性;同时,M6在颅脑内分布,表明M6可透过血脑屏障。第四部分M6与人、猪及大鼠血浆蛋白结合率研究实验目的观察M6与人、猪及大鼠血浆蛋白结合率实验方法M6含量检测方法采用外标法检测,采用超滤法研究M6在人、猪和大鼠血浆蛋白结合率,检测超滤液内的样品浓度,计算血浆蛋白结合率,公式血浆蛋白结合率(%)=(实际加入浓度-超滤液浓度)／实际加入浓度×100%,评价M6在各种属血浆中的蛋白结合率。实验结果本次试验结果显示, M6含量测定曲线为Y=4.5268)(+3.8703(R2=0.9999),曲线拟合度好,均符合含量检测要求。M6高、中、低浓度试验回收率为97.42±0.19%、97.41±3.36%、99.81±11.49%,回收率均高于95%,超滤膜对M6无滞留作用,可用于测定M6在血浆中游离浓度的检测。高浓度剂量M6与人血浆蛋白结合高,M6人血浆蛋白结合率99%,大鼠结合率为70.59±0.161%,猪血浆结合率为74.59±0.0.084%,其他种属血浆蛋白结合率均大于93%,显示M6为高强度蛋白结合。结论M6在高浓度中显示为74.59±0.0.084%的结合,而在中、低浓度结合率中显示则为99%,这可能与高浓度的M6没能与猪血浆蛋白充分结合有关。这与大鼠中的血浆结合蛋白结合情况相吻合,提示血浆蛋白结合与药物浓度具有依赖性。第五部分M6对OGD模型损伤PC-12细胞、新生鼠心肌细胞及神经元细胞的影响实验目的观察M6对OGD模型损伤PC-12细胞、新生鼠心肌细胞及神经元细胞的影响实验方法PC-12细胞、新生鼠心肌细胞及神经元细胞分成空白组、模型组、剂量处理组(20μmol/L、12μmol/L、4μmol/L),人工模拟OGD模型损伤2h后,复氧复糖继续培养24h,CCK8法检测各实验组生长存活率。实验结果结果显示,模型组与对照组OD值比较,具有显著性差异(p0.05),证实模型组可对细胞产生抑制或损伤作用。M6作用于PC-12细胞OGD损伤,总体呈保护损伤效果,高剂量浓度在20μmol/L作用下,与模型组有显著性的统计学意义(p0.05),其抗损伤效果与M6剂量为正相关作用；在心肌细胞模型中,M6同样如此,结果显示,不同剂量浓度均对心肌细胞模型具有抗损伤效果(p0.05),反映M6作用在抗心肌细胞OGD模型效果较好；在神经元细胞OGD模型中,M6低、中、高剂量与模型组比较具有显著性(p0.05)。结论M6对OGD损伤PC-12细胞、新生鼠心肌细胞及神经元细胞均有保护作用,且呈剂量依赖性,提示M6有望作为新型的靶点药物,有必要进行下一步药效学的研究。
【关键词】：M6 结构确证 质谱 核磁共振氢谱 核磁共振碳谱 M6 HPLC 含量检测 生物样品 M6 血浆药代动力学 组织分布特点 HPLC M6 大鼠血浆 人血浆 猪血浆 血浆蛋白结合率 M6 OGD损伤保护 PC-12 原代心肌细胞 神经元细胞
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R914.5;R96
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 前言22-32
• 第一章 盐酸椒苯酮胺代谢产物M6的合成及鉴定研究32-44
• 1.1 仪器与材料32
• 1.2 实验与方法32-34
• 1.3 实验结果34-41
• 1.4 小结与讨论41-44
• 第二章 M6在生物样品中HPLC-UV含量测定方法的建立44-51
• 2.1 仪器与材料44
• 2.2 实验方法44-45
• 2.3 方法学考察45-49
• 2.4 小结与讨论49-51
• 第三章 M6在SD大鼠中药代动力学的初步研究51-57
• 3.1 仪器与材料51
• 3.2 实验与方法51-53
• 3.3 实验结果53-55
• 3.4 小结与讨论55-57
• 第四章 M6与人、猪及大鼠血浆蛋白结合率研究57-62
• 4.1 仪器与材料57
• 4.2 实验与方法57-58
• 4.3 实验结果58-60
• 4.4 小结与讨论60-62
• 第五章 M6对OGD模型损伤PC-12细胞、新生鼠心肌细胞及神经元细胞的影响62-73
• 5.1 仪器与材料62-64
• 5.2 实验方法64-67
• 5.3 实验结果67-71
• 5.4 小结与讨论71-73
• 第六章 总结73-75
• 参考文献75-80
• 攻读硕士期间成果80-81
• 致谢81-82

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