大肠杆菌K12外排泵及调控基因缺失菌株的构建及其功能的研究

发布时间：2017-07-19 22:03

  本文关键词：大肠杆菌K12外排泵及调控基因缺失菌株的构建及其功能的研究

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【摘要】：细菌对抗生素耐药性的产生伴随着抗生素长期大量的使用,细菌耐药性的产生方式有多种,其中对于革兰氏阴性杆菌中的大肠杆菌而言,外排泵Acr AB-Tol C是引起其对多种抗生素耐药的一个最重要的系统,本文旨在研究外排泵基因或者部分调控基因缺失后菌株在环丙沙星选择压力下耐药性的产生机制。本研究首先利用Red同源重组建立了大肠杆菌K12染色体基因敲除技术,将以两端携带FRT序列的质粒p KD3和p KD4为模板扩增出的PCR产物成功替代了大肠杆菌K12中的acr A、acr B、tol C、mar A、mar R、sox S和sox R,获得了外排泵基因及调控基因敲除菌,测定原菌K12以及7株敲除菌的生长曲线,利用半固体琼脂方法测定了8株菌的移动能力,发现各敲除菌的生长速率以及移动能力没有显著改变。在环丙沙星浓度递增的条件下诱导K12及其敲除菌株,分别获得系耐药菌株,采用二倍稀释法测定各菌株的MIC,利用PCR的方法检测了gyr A、gyr B、par C和par E基因QRDR区的突变以及负向调控因子acr R、mar R、sox R突变情况。利用RT-PCR方法检测了诱导突变株中外排泵基因、调控基因和膜孔蛋白基因的表达水平。结果表明,当敲除Acr AB-Tol C中的tol C基因时,在浓度递增的环丙沙星选择压力下很难筛选出耐药菌株,说明Acr AB-Tol C的完整性对菌株耐药性发展有重要作用。诱导耐药株靶位基因突变类型具有多样性,与耐药有关的突变位点有Gyr A的Ser83Leu、Asp87Gly、Asp87His和Par C的Gly78Asp。外排泵基因acr A或者acr B基因缺失的菌株,其获得低水平耐药主要与靶位基因突变有关,其获得高水平耐药主要由于与其存在功能冗余的外排泵Acr EF被激活,增加药物外排所致。诱导耐药发展过程中,菌株的膜孔蛋白Omp F的表达水平不断下降,使得药物进入细胞的通道减少。正向调控基因mar A和sox S缺失后,在环丙沙星选择压力下仅能筛选出对环丙沙星敏感性降低的菌株,而负调控基因mar R和sox R缺失后,在环丙沙星选择压力下能筛选出对环丙沙星的耐药株。所有缺失株仅在gyr A发生单突变。以上结果说明mar A和sox S对Acr AB-Tol C的正向调控是通过解除了mar R和sox R对mar A和sox S的阻遏来实现的。本研究表明Acr AB-Tol C外排泵功能的完整性对细菌耐药性发展发挥重要作用,当其功能破坏,与其存在功能冗余的外排泵Acr EF发挥替代作用。
【关键词】：大肠杆菌 基因敲除 AcrAB-TolC AcrEF 靶位突变
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要3-4
• abstract4-6
• 常用缩略词6-9
• 1 前言9-15
• 1.1 细菌的耐药机制9-10
• 1.2 主动外排泵系统与多重耐药（MDR，Multi Drug Resistance）10-11
• 1.3 靶位基因突变及主动外排系统对氟喹诺酮类耐药的作用11-12
• 1.4 外膜蛋白12-13
• 1.5 基因敲除技术在外排泵机制研究中的应用13-15
• 2 材料和方法15-32
• 2.1 材料15-17
• 2.1.1 菌株及质粒15
• 2.1.2 药物、培养基及主要试剂15-16
• 2.1.3 常用试剂的配制16
• 2.1.4 主要仪器设备16-17
• 2.2 大肠杆菌K12外排泵及调控基因缺失株的构建17-23
• 2.2.1 菌株的复苏17
• 2.2.2 大肠杆菌K12电转化感受态细胞的制备17-18
• 2.2.3 质粒的提取18
• 2.2.4 电转化18-19
• 2.2.5 含质粒pKD46的大肠杆菌K12感受态细胞的制备19
• 2.2.6 Kan或Chl抗性基因片段的制备19-22
• 2.2.7 电转化22-23
• 2.3 外排泵及调控基因缺失株功能的研究23-32
• 2.3.1 原菌K12及基因缺失株生长特性的测定23
• 2.3.2 二倍琼脂稀释法测定环丙沙星最小抑菌浓度（MICs）23-25
• 2.3.3 体外诱导及突变频率的测定25
• 2.3.4 原菌、敲除菌及诱导菌靶位基因突变的检测25-27
• 2.3.5 诱导突变株中外排泵相关基因表达水平检测27-32
• 3 结果与分析32-46
• 3.1 成功构建大肠杆菌K12外排泵及调控基因缺失株32-33
• 3.2 原菌及敲除菌生长特性测定结果33
• 3.3 原菌、敲除菌及诱导菌MIC测定及靶位基因突变检测结果33-37
• 3.4 外排泵基因及相关基因表达水平检测结果37-46
• 4 讨论46-50
• 全文总结50-51
• 致谢51-52
• 参考文献52-55

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本文编号：564997