还原-pH双重响应的PAMAM纳米粒联合携载阿霉素与乳腺癌MDR逆转剂依克立达的研究

发布时间：2017-07-25 15:32

  本文关键词：还原-pH双重响应的PAMAM纳米粒联合携载阿霉素与乳腺癌MDR逆转剂依克立达的研究

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【摘要】：目的:基于聚酰胺-胺树状大分子(PAMAM),制备还原、pH双重敏感的纳米载体PSSP,用于联合携载化疗药物阿霉素(DOX)及耐药逆转剂依克立达(ELC),同时对其逆转乳腺癌多药耐药的效果进行体内外评价。方法:本文采用氢谱(1H NMR)、红外光谱(FTIR)对载体PSSP进行结构表征。利用疏水作用同时负载DOX和ELC制备联载药纳米粒PSSP/DOX/ELC,并对其进行粒径、电位、包封率和载药量的表征。通过透析袋法考察纳米粒的体外释放行为。以MCF-7(对DOX敏感)和MCF-7/ADR(对DOX不敏感)的人乳腺癌细胞为主要的模型细胞,通过MTT法分别测定空白载体、游离ELC、PSSP/DOX和PSSP/DOX/ELC纳米粒的细胞毒性,计算相应的IC50、耐药倍数和逆转因子。通过激光共聚焦(CLSM)、流式细胞仪和酸化异丙醇萃取法对载药纳米粒的摄取情况进行定性及定量分析。选取代表性的抑制剂考察细胞摄取机制,并通过还原、酸抑制剂考察纳米粒在细胞内的释药情况。以P-gp的自然底物罗丹明123为模型药,利用流式细胞术考察ELC在细胞内的起效浓度以及对药物外排的抑制效果。利用ATP检测试剂盒及流式细胞术进一步考察ELC的作用机制。载药纳米粒的体内抗肿瘤实验在MCF-7荷瘤裸鼠的体内进行的,并采用HE染色的方法考察肿瘤和主要器官的病理变化。结果:1H NMR和FTIR结果显示,载体PSSP成功合成。制备的不同DOX:ELC摩尔比的纳米粒粒径在10~20 nm之间,Zeta电位在+2~5 mV之间。所制备的纳米粒具有较高的包封率,同时负载两药时DOX载药量在10%左右,ELC也可达到2%左右。PSSP/DOX/ELC纳米粒中两药体外同时释放呈现明显的还原、pH敏感性。空白载体和游离ELC无明显的细胞毒性。与PSSP/DOX相比,PSSP/DOX/ELC联载纳米粒表现出较强的细胞毒性和多药耐药的逆转效果,细胞摄取实验结果同样表明PSSP/DOX/ELC的摄取显著高于PSSP/DOX,由此证明DOX与ELC联用增加DOX的抗肿瘤活性。纳米粒主要通过网格蛋白介导的途径进入细胞,在细胞中利用溶酶体的酸环境和胞质的高还原环境释药。ELC可在低浓度条件下抑制P-gp对DOX的外排,增加胞内含量,另一方面可能间接性引起胞内ATP水平的升高,从而增加能量依赖性的载体摄取,进一步提高DOX的入胞量。体内抑瘤实验表明PSSP/DOX/ELC纳米粒通过不同的给药策略均能明显抑制肿瘤生长,同时HE染色结果显示PSSP/DOX/ELC可显著降低DOX的毒副作用,此外PSSP/DOX/ELC还可有效遏制肿瘤耐药转变前期的药物外排应激反应,降低肿瘤治疗的难度。结论:本文基于PAMAM成功制备了具有还原、pH双敏感性的DOX和ELC联载纳米粒。所制备的纳米粒粒径均一,具有较高的包封率、载药量,体外释放呈现良好的还原、pH双重敏感性。体内外抗肿瘤活性实验结果显示,联载纳米粒可有效逆转乳腺癌多药耐药,增强DOX对肿瘤细胞的毒性,同时有效遏制一般肿瘤化疗初期由耐药转变引起的药物外排应激反应,降低肿瘤治疗的难度,减少毒副作用的发生。该抗肿瘤药物递送系统用于肿瘤治疗具有广阔的应用前景。
【关键词】：阿霉素 依克立达 多药耐药 PAMAM 还原-pH双敏感
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96;R943
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 前言13-21
• 1. MDR逆转及其应对策略13-15
• 1.1 MDR产生机制13
• 1.2 P-糖蛋白13-14
• 1.3 MDR逆转及其策略14-15
• 1.4 第三代P-gp抑制剂——依克利达15
• 2. 阿霉素与新型递药系统15-16
• 3. 联合用药与MDR逆转研究进展16
• 4. 条件响应性纳米递药系统研究进展16-19
• 4.1 pH敏感型16-17
• 4.2 还原敏感型17
• 4.3 其他敏感型17-18
• 4.4 以聚酰胺-胺树状大分子为核心的纳米递药系统18-19
• 5. 课题设计思路及意义19-21
• 第一章 载体PAMAM-S-S-PEG的合成及表征21-25
• 1 材料与仪器21
• 1.1 材料与试剂21
• 1.2 仪器21
• 2 实验方法21-22
• 2.1 PAMAM-S-S-PEG的合成21-22
• 2.2 PAMAM-S-S-PEG的结构验证22
• 2.2.1 PAMAM-S-S-PEG的 1H-NMR核磁表征22
• 2.2.2 PAMAM-S-S-PEG的FTIR分析22
• 3 实验结果22-24
• 3.1 PAMAM-S-S-PEG的 1H-NMR分析22-23
• 3.2 PAMAM-S-S-PEG的FTIR分析23-24
• 4 讨论与小结24-25
• 第二章 纳米粒PSSP/DOX/ELC的制备及表征25-35
• 1 材料与仪器25
• 1.1 材料与试剂25
• 1.2 仪器25
• 2 实验方法25-28
• 2.1 DOX体外分析方法的建立25-26
• 2.1.1 DOX紫外吸收波长（λ max）的确定25-26
• 2.1.2 DOX标准曲线的绘制26
• 2.1.3 精密度、回收率试验26
• 2.2 ELC体外分析方法的建立26-27
• 2.2.1 色谱条件的确定26
• 2.2.2 ELC标准曲线的绘制26
• 2.2.3 精密度、回收率试验26-27
• 2.3 联载纳米粒PSSP/DOX/ELC的制备27
• 2.4 联载纳米粒PSSP/DOX/ELC的表征27-28
• 2.4.1 载药量、包封率测定27
• 2.4.2 粒径、电位表征27
• 2.4.3 纳米粒体外释放考察27-28
• 3 实验结果28-34
• 3.1 DOX体外分析方法的建立28-29
• 3.1.1 DOX紫外吸收波长（λ max）的确定28-29
• 3.1.2 DOX标准曲线的绘制29
• 3.1.3 精密度、回收率试验29
• 3.2 ELC体外分析方法的建立29-30
• 3.2.1 HPLC方法专属性及标准曲线绘制29-30
• 3.2.2 精密度、回收率试验30
• 3.3 联载纳米粒PSSP/DOX/ELC的表征30-34
• 3.3.1 纳米粒包封率、载药量测定30-31
• 3.3.2 纳米粒粒径、电位测定31-32
• 3.3.3 纳米粒体外释放考察32-34
• 4 讨论与小结34-35
• 第三章 纳米粒PSSP/DOX/ELC体外抗肿瘤活性研究35-56
• 1 材料与仪器35-36
• 1.1 材料与试剂35
• 1.2 仪器35-36
• 2 实验方法36-42
• 2.1 细胞培养36
• 2.2 ELC起效浓度考察36
• 2.3 细胞毒性实验36-38
• 2.3.1 MTT实验原理及基本操作36-37
• 2.3.2 空白载体及游离ELC细胞毒性实验37
• 2.3.3 联载纳米粒细胞毒性实验37-38
• 2.4 细胞摄取实验38-39
• 2.4.1 共聚焦定性分析38
• 2.4.2 流式定量考察38
• 2.4.3 细胞内DOX定量测定38-39
• 2.5 胞内药物递送实验39-40
• 2.5.1 摄取机制考察39
• 2.5.2 联载纳米粒细胞内共定位实验39
• 2.5.3 还原、酸敏感性考察39-40
• 2.6 ELC作用机制40-42
• 2.6.1 蓄积和外排实验40
• 2.6.2 ELC促摄取作用机制考察40-42
• 2.7 数据统计42
• 3 实验结果42-54
• 3.1 ELC起效浓度考察42-43
• 3.2 细胞毒性实验43-46
• 3.2.1 空白载体及游离ELC细胞毒性实验43-44
• 3.2.2 联载纳米粒细胞毒性实验44-46
• 3.3 细胞摄取实验46-49
• 3.3.1 共聚焦定性分析46-47
• 3.3.2 流式定量分析47-48
• 3.3.3 细胞内DOX定量测定48-49
• 3.4 胞内药物递送实验49-52
• 3.4.1 摄取机制考察49-50
• 3.4.2 细胞内共定位实验50-51
• 3.4.3 还原、酸敏感性考察51-52
• 3.5 ELC作用机制考察52-54
• 3.5.1 蓄积和外排实验52-53
• 3.5.2 ELC作用机制假设及验证53-54
• 4 讨论与小结54-56
• 第四章 纳米粒PSSP/DOX/ELC体内抗肿瘤活性研究56-68
• 1 材料与仪器56
• 1.1 材料与试剂56
• 1.2 仪器56
• 1.3 动物56
• 2 实验方法56-58
• 2.1 MCF-7 荷瘤裸鼠模型的建立56
• 2.2 荷瘤裸鼠活体荧光成像实验56-57
• 2.3 体内抗肿瘤活性研究57
• 2.4 肿瘤及各主要器官病理学观察57
• 2.5 体内预防和逆转多药耐药的研究57-58
• 2.5.1 细胞膜表面P-gp表达与DOX诱导57-58
• 2.5.2 PSSP/DOX/ELC预防和逆转多药耐药58
• 3 实验结果58-66
• 3.1 荷瘤裸鼠活体荧光成像实验58-60
• 3.2 体内抗肿瘤活性研究60-61
• 3.3 肿瘤及各主要器官病理学观察61-63
• 3.4 体内预防和逆转多药耐药转变的研究63-66
• 3.4.1 细胞膜表面P-gp表达及DOX诱导63-64
• 3.4.2 PSSP/DOX/ELC预防和逆转多药耐药64-66
• 4 讨论与小结66-68
• 全文总结68-70
• 后续工作与展望70-71
• 参考文献71-80
• 攻读硕士期间公开发表的论文80-81
• 缩略词表81-83
• 致谢83-85

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