四氯苯醌激活HepG2细胞Nrf2/ARE信号通路的机制分析
发布时间：2023-11-09 19:15
四氯苯醌(TCBQ)是工业除草剂五氯酚的代谢产物,其体内外模型已显示出活性氧机制诱导的肝毒性和遗传毒性作用。Nrf2/ARE信号通路在机体内的抗氧化过程中发挥重要作用,它可以有效诱导Ⅱ相解毒酶及抗氧化蛋白的表达。Keap1和Bach1均是机体内Nrf2/ARE信号通路的重要转录抑制因子,在Nrf2通路的激活中发挥重要作用。该研究的目的是为了分析TCBQ能否激活Nrf2/ARE信号通路,并探讨其具体的激活机制,可以为TCBQ诱导毒性干预的治疗提供依据。第一部分:Nrf2/ARE信号通路的激活需要Nrf2和Keap1的解离,该部分的研究分析了TCBQ能否激活Nrf2信号通路,并分析了Keap1在Nrf2信号通路激活中的重要作用。HepG2细胞在使用TCBQ给药后,发现Nrf2及抗氧化蛋白HO-1、NQO1的表达上调,并存时间和剂量依赖关系。免疫荧光实验同样证明了TC BQ作用后Nrf2表达的上调。q RT-PCR实验显示了Nrf2而非Keap1基因表达水平的上调。Western Blot分别检测细胞核、质蛋白内Nrf2的变化,清晰证明了Nrf2由细胞质转移进入细胞核的过程。双荧光素酶实验显...
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩写符号对照表
第一章 绪论
1.1 引言
1.2 四氯苯醌
1.2.1 四氯苯醌的理化性质
1.2.2 四氯苯醌的用途
1.3 活性氧的简介
1.4 Nrf2/ARE信号通路
1.4.1 Nrf2的结构与功能
1.4.2 ARE的结构与功能
1.4.3 Nrf2/ARE通路的作用
1.5 Keap1依赖的Nrf2调控
1.5.1 Keap1的结构与功能
1.5.2 Keap1对于Nrf2的调控机制
1.6 Bach1与Nrf2的竞争性调控
1.7 立体依据及意义
第二章 TCBQ通过Keap1交联二聚体的形成和Ub的转移激活Nrf2通路
2.1 引言
2.2 材料与试剂
2.2.1 仪器设备
2.2.2 溶液与试剂
2.3 实验方法
2.3.1 细胞培养
2.3.2 免疫荧光实验
2.3.3 蛋白质的提取
2.3.4 荧光定量PCR实验
2.3.5 双荧光素酶报告基因分析
2.3.6 GSH含量测定
2.3.7 免疫沉淀实验
2.3.8 免疫印迹实验
2.3.9 统计分析
2.4 实验结果
2.4.1 TCBQ诱导肝癌细胞中Nrf2激活以及HO-1 和NQO1的表达
2.4.2 TCBQ增加Nrf2却减少Keap1的mRNA水平
2.4.3 TCBQ诱导Nrf2入核并和ARE信号元件结合
2.4.4 TCBQ诱导Keap1交联二聚体的形成
2.4.5 TCBQ不能诱导Keap1和Cul3的解离
2.4.6 TCBQ降低Nrf2但增加Keap1的泛素化水平
2.5 讨论
第三章 TCBQ通过Bach1快速出核和JNK-P62途径激活Nrf2通路
3.1 引言
3.2 溶液与试剂
3.3 实验方法
3.3.1 免疫印迹分析
3.3.2 免疫荧光分析
3.3.3 染色质免疫沉淀实验
3.3.4 转染干扰RNA实验
3.3.5 荧光定量PCR
3.3.6 统计分析
3.4 结果与讨论
3.4.1 TCBQ诱导Bach1的快速出核
3.4.2 TCBQ诱导Bach1与Crm1交互以及酪氨酸的磷酸化
3.4.3 TCBQ调节Bach1和Nrf2与ARE的结合
3.4.4 TCBQ上调Bach1的泛素化水平
3.4.5 TCBQ上调Bach1蛋白和mRN A的表达水平
3.4.6 放线菌酮抑制Bach1蛋白的表达
3.4.7 P62参与TCBQ诱导的Nrf2激活和抗氧化基因的表达
3.4.8 JNK途径参与TCBQ诱导的P62和HO-1 的表达
3.5 总结
参考文献
致谢
作者攻读硕士学位期间已发表科研成果
本文编号：3861854
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩写符号对照表
第一章 绪论
1.1 引言
1.2 四氯苯醌
1.2.1 四氯苯醌的理化性质
1.2.2 四氯苯醌的用途
1.3 活性氧的简介
1.4 Nrf2/ARE信号通路
1.4.1 Nrf2的结构与功能
1.4.2 ARE的结构与功能
1.4.3 Nrf2/ARE通路的作用
1.5 Keap1依赖的Nrf2调控
1.5.1 Keap1的结构与功能
1.5.2 Keap1对于Nrf2的调控机制
1.6 Bach1与Nrf2的竞争性调控
1.7 立体依据及意义
第二章 TCBQ通过Keap1交联二聚体的形成和Ub的转移激活Nrf2通路
2.1 引言
2.2 材料与试剂
2.2.1 仪器设备
2.2.2 溶液与试剂
2.3 实验方法
2.3.1 细胞培养
2.3.2 免疫荧光实验
2.3.3 蛋白质的提取
2.3.4 荧光定量PCR实验
2.3.5 双荧光素酶报告基因分析
2.3.6 GSH含量测定
2.3.7 免疫沉淀实验
2.3.8 免疫印迹实验
2.3.9 统计分析
2.4 实验结果
2.4.1 TCBQ诱导肝癌细胞中Nrf2激活以及HO-1 和NQO1的表达
2.4.2 TCBQ增加Nrf2却减少Keap1的mRNA水平
2.4.3 TCBQ诱导Nrf2入核并和ARE信号元件结合
2.4.4 TCBQ诱导Keap1交联二聚体的形成
2.4.5 TCBQ不能诱导Keap1和Cul3的解离
2.4.6 TCBQ降低Nrf2但增加Keap1的泛素化水平
2.5 讨论
第三章 TCBQ通过Bach1快速出核和JNK-P62途径激活Nrf2通路
3.1 引言
3.2 溶液与试剂
3.3 实验方法
3.3.1 免疫印迹分析
3.3.2 免疫荧光分析
3.3.3 染色质免疫沉淀实验
3.3.4 转染干扰RNA实验
3.3.5 荧光定量PCR
3.3.6 统计分析
3.4 结果与讨论
3.4.1 TCBQ诱导Bach1的快速出核
3.4.2 TCBQ诱导Bach1与Crm1交互以及酪氨酸的磷酸化
3.4.3 TCBQ调节Bach1和Nrf2与ARE的结合
3.4.4 TCBQ上调Bach1的泛素化水平
3.4.5 TCBQ上调Bach1蛋白和mRN A的表达水平
3.4.6 放线菌酮抑制Bach1蛋白的表达
3.4.7 P62参与TCBQ诱导的Nrf2激活和抗氧化基因的表达
3.4.8 JNK途径参与TCBQ诱导的P62和HO-1 的表达
3.5 总结
参考文献
致谢
作者攻读硕士学位期间已发表科研成果
本文编号：3861854
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/yufangyixuelunwen/3861854.html