挫伤骨骼肌纤维化的发生机制研究

发布时间：2020-11-17 14:04

　　研究目的:急性骨骼肌损伤在运动损伤中较为常见,损伤骨骼肌有强大的自我修复能力,但纤维沉积的速度要快于肌肉再生,在损伤较为严重时,骨骼肌会伴有纤维化的发生。本课题组前期研究也观察到挫伤骨骼肌修复过程中存在纤维化现象,但机制尚不清楚。伴有纤维化的骨骼肌的生物力学特性较差,容易发生再次损伤,从而影响运动能力。因此我们建立了钝挫伤骨骼肌纤维化模型。探究各种细胞因子包括:炎症因子、趋化因子、氧化应激因子、Notch信号通路调节因子和巨噬细胞在损伤骨骼肌修复过程中的表达规律与骨骼肌纤维化的关系。此外,我们还探究巨噬细胞和转化生长因子(TGF-β1)在损伤骨骼肌纤维化形成过程中的作用及可能关系。研究方法:40只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组(C组,n=8)骨骼肌纤维化模型组(S,n=32)。在骨骼肌钝挫伤后3d,6d,12d和24d取小鼠双侧腓肠肌。Masson三色染色观察挫伤骨骼肌12天和24天胶原纤维的沉积情况。荧光定量PCR检测炎症因子、氧化应激因子、趋化因子、巨噬细胞标志物、Notch信号通路调节因子及转化生长因子m RNA的表达变化规律。免疫荧光双标检测转化生长因子(TGF-β1)和巨噬细胞标志物F4/80的表达和共定位情况。研究结果:1.挫伤骨骼肌修复过程中胶原纤维Masson染色及胶原蛋白荧光定量PCR检测结果损伤12天和24天的小鼠骨骼肌组织对照组相比均有明显的胶原纤维的沉积,即伴有不同程度的骨骼肌纤维化。且与第24天相比第12天胶原纤维的沉积量较高。荧光定量PCR数据分析显示,Ⅰ胶原蛋白COL1A1和Ⅲ型胶原蛋白COL3A1m RNA均在骨骼肌损伤的第3天和第6天与对照组相比显著增加(p0.01),之后迅速下降。2.挫伤骨骼肌修复过程中TGF-β1与F4/80免疫荧光双标及荧光定量PCR检测结果免疫荧光双标实验结果显示,与对照组相比损伤后的第3天TGF-β1和F4/80的表达最高之后减少24天几乎消失。同样发现重合的黄色区域也是在损伤后的第3天和第6天较为显著,随后下降。说明骨骼肌损伤后的第3天和第6天巨噬细胞表达了TGF-β1且表达量较高。荧光定量PCR数据分析显示,TGF-β1m RNA也是在骨骼肌损伤的第3天、第6天和第12天表达量与对照组相比均显著增加(p0.01)。巨噬细胞标志物F4/80m RNA同样在骨骼肌损伤的第3天和第6天表达显著增加(p0.01),之后迅速下降。3.挫伤骨骼肌修复过程中趋化因子荧光定量PCR检测结果荧光定量PCR测定了CC家族CXC家族趋化因子的趋化性,数据显示,CCL2m RNA在骨骼肌损伤后第3天已经开始显著性升高(p0.01),随后开始下降,但第6天与第12天对照组相比仍具有显著性差异(p0.01)。CCL5m RNA在骨骼肌损伤后第3天显著性增加(p0.01),第6天达到最高水平,随后m RNA水平虽有下降,但与对照组相比,第12天仍显著增加(p0.05)。CCR2m RNA在骨骼肌损伤后第3天显著性增加(p0.01),随后m RNA水平虽有下降,但第6天和第12天对照组相比,仍显著增加(p0.01,p0.05)。CXCL12仅在伤后第3天表达与对照组相比显著增加(p0.01),随后迅速下降。CXCR4m RNA在伤后第3天,第6天表达与对照组相比均显著增加(p0.01),第3天达到峰值随后开始下降。4.挫伤骨骼肌修复过程中炎症因子荧光定量PCR检测结果荧光定量PCR实验测定了炎症因子的表达水平。数据显示,炎症因子TWEAK m RNA在骨骼肌损伤后第3天和第6天与对照组相比表达均显著性增加(p0.01)。TWEAK受体Fin14在骨骼肌损伤后第3天表达显著增加(p0.01),之后逐渐下降。5.挫伤骨骼肌修复过程中氧化应激因子荧光定量PCR检测结果荧光定量PCR结果显示,氧化应激因子gp91m RNA(NADPH氧化酶关键亚基)在伤后第3天和第6天表达量与对照组相比均显著增加,且在损伤后第3天达到峰值(p0.01),随后开始下降。6.挫伤骨骼肌修复过程中Notch信号通路调节因子荧光定量PCR检测结果荧光定量PCR的结果显示Hes1m RNA在骨骼肌损伤后的第3天和第6天与对照组相比显著增加。Hey1m RNA在骨骼肌损伤后的第3天和第6天也显著增加,之后下降。Hey2m RNA仅在第12天与对照组相比有显著增加。Hey Lm RNA仅在骨骼肌损伤的第6天显著增加之后迅速下降。研究结论:(1)骨骼肌损伤修复过程中转化生长因子TGF-β1表达及巨噬细胞浸润过量增加可能对损伤骨骼肌纤维化的形成发挥重要作用。此外,骨骼肌修复期间,巨噬细胞分泌的TGF-β1可能促进了损伤骨骼肌纤维化的发生。(2)挫伤骨骼肌纤维化形成过程中Notch信号通路调节因子Hes1,Hey1,Hey2,Hey L;炎症因子TWEAK/Fn14;氧化应激因子gp91-phox;趋化因子CCL2,CCL5,CCR2,CXCR4,CXCL12均高水平表达,这些因子可能参与了损伤骨骼肌纤维化的形成。
【学位单位】：上海体育学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R87
【部分图文】：

路线图,实验技术,路线图

挫伤骨骼肌纤维化的发生机制研究3.材料与方法3.1 材料3.1.1 实验对象与分组40只SPF级8周龄健康C57BL/6雄性小鼠(北京维通利华实验动物有限公司小鼠体重都约 18—25g。将 40 只小鼠随机分为钝挫伤纤维化模型组即 S 组(32 只和未损伤对照组即 C 组(8 只)。损伤纤维化模型组根据取材时间点不同分为3d,6d,12d,24d 四个组，每组每个时间点 8 只。3.1.2 技术路线

胶原纤维,骨骼肌,Ⅲ型胶原蛋白,Ⅰ型胶原蛋白

图 2 损伤骨骼肌组织 Masson 三色染色结果比较胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色；细胞核呈蓝黑色损伤12天和24天的小鼠骨骼肌组织与对照组相比均有明显的胶原纤维的沉积表明挫伤骨骼肌发生了纤维化。且与第 24 天相比第 12 天胶原纤维的沉积量较高。图 3 损伤骨骼肌修复过程中胶原蛋白 mRNA 表达规律（与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01）荧光定量 PCR 数据分析显示，Ⅰ型胶原蛋白 COL1A1 和Ⅲ型胶原蛋白

修复过程,骨骼肌,胶原蛋白,规律

4 实验结果4.1 损伤骨骼肌修复过程中 Masson 三色染色结果及胶原蛋白 mRNA 表达图 2 损伤骨骼肌组织 Masson 三色染色结果比较胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色；细胞核呈蓝黑色损伤12天和24天的小鼠骨骼肌组织与对照组相比均有明显的胶原纤维的沉积表明挫伤骨骼肌发生了纤维化。且与第 24 天相比第 12 天胶原纤维的沉积量
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