三嵌段聚合物胶束共转运阿霉素和siRNA用于逆转耐药和协同抗癌的研究

发布时间：2017-04-05 15:01

  本文关键词：三嵌段聚合物胶束共转运阿霉素和siRNA用于逆转耐药和协同抗癌的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:制备同时递送阿霉素和si RNA的共转运递药系统(si RNA-Dox-micelle),考察其肿瘤靶向及耐药逆转,提供一种用于协同抗肿瘤的新策略。方法:(1)合成N-琥珀酰壳聚糖-聚L赖氨酸-软脂酸三嵌段聚合物(NSC-PLL-PA),并在此基础上制备共转运si RNA和Dox胶束(si RNA-Dox-micelle)。(2)考察si RNAmicelle、Dox-micelle和si RNA-Dox-micelle的体外细胞摄取和亚细胞分布特性,探究不同阿霉素制剂在细胞内的摄取与消除。(3)从细胞内药物蓄积的角度阐明造成不同阿霉素制剂体外药效学差异的原因。(4)考察si RNA-micelle的转染效率和si RNA-Dox-micelle的肿瘤靶向性,初步探讨P-gp在细胞间的转移对化疗药物药效学的影响,从逆转耐药和增强肿瘤靶向方面提高si RNA-Dox-micelle协同增效的抗肿瘤作用。结果:(1)通过缩合法成功地制备了NSC-PLL-PA三嵌段聚合物,N-琥珀酰壳聚糖(NSC)作为亲水性外壳用于延长胶束在血液循环中的半衰期和降低聚L-赖氨酸(PLL)的毒性,PLL作为阳离子层用以吸附si RNA,软脂酸(PA)作为疏水层用来包载阿霉素。该聚合物在水溶液中有很强的胶束化行为,疏水端易于自聚集而压缩进胶束内核。制备得到的胶束外观圆整,粒径分布均匀,能够高效包载Dox和si RNA。并且,si RNA-Dox-micelle在p H 5.3条件下没有在p H 7.4条件下稳定,易于在酸性条件下释放所负载的Dox和si RNA。(2)si RNA-Dox-micelle能同时转运Dox和si RNA,从而使抗癌药物和基因在同一细胞内共定位。并且随着孵育时间的延长,细胞内的荧光增强,携带两种颜色荧光的细胞比例增加,抗癌药物和基因在同一细胞内累积从而更好的发挥协同增效的作用;Dox信号最终由细胞质扩散到细胞核,但si RNA信号始终定位于细胞质,这有利于他们在各自的靶部位发挥协同增效的作用。(3)共转运胶束能够一定程度上避开外排泵的作用,下调耐药细胞表面P-gp的表达,增加细胞内阿霉素的浓度,并且细胞内药物蓄积越多,引起的细胞毒性越大。(4)si RNA-micelle能够有效递送si RNA进入靶细胞沉默P-gp的表达,但是P-gp能够在细胞间转移并保留其生物学活性,而且,P-gp在细胞间的传递不依赖于mdr1的转录,一定程度上限制了si RNA-micelle体内疗效的发挥;si RNA-Dox-micelle表现出协同增效的的抗肿瘤活性并能够明显改善裸鼠的生存质量;并且,si RNA在体内能够有效逆转肿瘤耐药,一定程度上增强了Dox的抗肿瘤作用。结论:合成的NSC-PLL-PA三嵌段聚合物能够高效负载si RNA和Dox,并且在细胞内有效释放;制备得到的si RNA-Dox-micelle能够靶向肿瘤部位,沉默P-gp表达,逆转肿瘤耐药,发挥协同抗肿瘤作用,是一种安全有效的药物递送系统。
【关键词】：共转运 逆转耐药 阿霉素 siRNA 协同抗癌
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-29
• 第一章 嵌段聚合物载体的合成29-41
• 材料29-30
• 方法与结果30-39
• 一、聚合物的合成与表征30-34
• 1. 聚合物的合成30-31
• 2. 聚合物的表征31-34
• 二、聚合物理化性质的分析34-36
• 1. 临界胶束浓度（CMC）的测定34-36
• 2. 粒径和表面电位测定36
• 三、聚合物的安全性评价36-39
• 1. 体外溶血实验36-38
• 2. 细胞毒性试验38-39
• 讨论与小结39-41
• 第二章 载药胶束的制备及细胞摄取特性研究41-62
• 材料41-42
• 方法与结果42-60
• 一、Dox-micelle的制备及工艺优化42-51
• 1. 分析方法42-44
• 2. Dox-micelle的制备方法44-45
• 3. Dox-micelle的质量评价45-46
• 4. Dox-micelle制备工艺的优化46-49
• 5. Dox-micelle的体外释放49-51
• 二、Dox-micelle的细胞摄取特性51-55
• 1. 流式细胞术检测Dox-micelle的细胞摄取51-52
• 2. 激光共聚焦显微镜观察Dox-micelle在细胞内的摄入与分布52-53
• 3. 载药胶束的细胞内吞机制研究53-55
• 三、细胞间P-gp的传递作用55-60
• 1. Dox-micelle的细胞毒性55-56
• 2. MTT实验考察细胞间P-gp的传递56
• 3. 流式细胞术观察细胞间P-gp的传递56-57
• 4. 激光共聚焦显微镜观察细胞间P-gp的传递57-58
• 5. RT-PCR及Western blot分析细胞间P-gp的传递58-60
• 讨论与小结60-62
• 第三章 聚合物胶束递送siRNA沉默靶基因的研究62-78
• 材料62-63
• 方法与结果63-76
• 一、siRNA-micelle理化性质的研究63-70
• 1. 琼脂糖凝胶电泳试验检验胶束结合siRNA的能力63-64
• 2. siRNA-micelle的肝素解络试验64-65
• 3. siRNA-micelle血清稳定学试验65-66
• 4. RNase酶稳定性评价66-67
• 5. 荧光替代（EB displacement）实验67-68
• 6. siRNA-micelle的体外释放68-69
• 7. MTT试验检测si RNA-micelle的生物相容性69-70
• 二、siRNA-micelle的细胞摄取与亚细胞分布70-72
• 1. 流式细胞术检测siRNA-micelle的细胞摄取70-71
• 2. 激光共聚焦显微镜观察siRNA-micelle在细胞内的摄入与分布71-72
• 三、siRNA-micelle下调P-gp表达的研究72-76
• 1. RT-PCR技术分析细胞内mdr1 mRNA的表达72-74
• 2. Western blot分析细胞内P-gp的表达74-76
• 讨论与小结76-78
• 第四章 聚合物胶束共转运阿霉素和siRNA的研究78-97
• 材料78-79
• 方法与结果79-95
• 一、siRNA-Dox-micell理化性质的考察79-81
• 1. siRNA-Dox-micelle的制备与表征79-80
• 2. siRNA-Dox-micelle稳定性考察80-81
• 二、siRNA-Dox-micelle的细胞摄取特性81-86
• 1. 双色流式细胞术考察Dox和siRNA的共转运81-82
• 2. 激光共聚焦显微镜观察Dox-siRNA-micelle在细胞内的摄入与分布82-83
• 3. 活细胞工作站观察Dox-siRNA-micelle在细胞内的累积与分布83-84
• 4. 定量测定Dox在细胞内的摄取动力学84-86
• 三、Dox-siRNA-micell的体外药效学考察86-91
• 1. MTT法考察给药时间间隔及siRNA浓度对体外药效学的影响86-88
• 2. MTT法考察不同Dox制剂的细胞毒性88-90
• 3. 激光共聚焦显微镜和流式细胞仪考察细胞内Dox的累积90-91
• 四、体内药效学与靶向性考察91-95
• 1. siRNA-Dox-micelle的体内药效学91-93
• 2. 近红外小动物成像研究siRNA-Dox-micelle的体内靶向性93-95
• 讨论与小结95-97
• 全文总结97-100
• 参考文献100-112
• 攻读学位期间发表的论文与其它112-114
• 英文缩略词表114-115
• 致谢115-116

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本文编号：287175