脊髓背角Paxillin对痛觉突触传递的调控作用

发布时间：2017-04-11 20:23

  本文关键词：脊髓背角Paxillin对痛觉突触传递的调控作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：Paxillin是一种包含多个功能结构域的信号连接蛋白。通过与黏着斑激酶(FAK)、Src家族酪氨酸激酶(SFKs)、C-末端Src激酶(CSK)等相结合,Paxillin密切调控着细胞粘附过程。在中枢神经系统,Paxillin也表达于兴奋性谷氨酸能突触中,但Paxillin的突触功能及其病理意义目前尚不清楚。本文在痛觉调控的关键部位---脊髓背角,探讨了Paxillin对痛觉突触传递的调节作用及其分子机制。方法：本文建立完全弗氏佐剂(CFA)诱发的慢性炎性疼痛模型,结合行为学、免疫共沉淀、免疫组织化学、场电位记录等方法,从Paxillin的突触定位、蛋白相互作用、信号传导等角度,研究了Paxillin在痛觉可塑性变化中的作用。结果：(1)Paxillin主要分布于脊髓背角神经元,且存在于突触后致密质(postsynaptic density; PSD)中；(2)免疫组化结果显示：突触活动(synapticactivity)能够动态调节Paxillin第118位酪氨酸残基(Paxillin-Yl 18)的磷酸化水平；当使用GABAA受体阻断剂bicuculline(100μM)处理离体脊髓片、以提高神经突触活动之后,Paxillin-Y118的磷酸化水平会明显降低,而这一作用可被N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体抑制剂D-APV(100μM)所阻断；与bicuculline相似,外周组织损伤也能引发脊髓背角Paxillin-Y118的去磷酸化；(3)为直接探讨Paxillin-Y118磷酸化改变的意义,我们构建了Paxillin(Y118E)和Paxillin(Y118F)两种突变体,以分别模拟Y118的磷酸化和去磷酸化,并通过重组腺病毒载体、使脊髓背角神经元过表达外源性Paxillin突变体,结果发现：Paxillin(Y118F)能够在正常动物诱发明显的痛觉超敏,增大脊髓背角C-纤维诱发场电位长时程增强(LTP)的幅度；而脊髓过表达Paxillin(Y118E)对正常动物的痛阈无明显影响,但却能降低LTP的幅度,提示：Paxillin-Y118的磷酸化水平密切调控脊髓敏感化过程；(4)Paxillin的痛觉调控作用,与SFKs以及NMDA受体有关；我们发现：Paxillin(Y118F)能够增强Src活性,促进Src对NMDA受体GluN2B亚基第1472位酪氨酸残基(GluN2B-Y1472)的磷酸化；鞘内注射SFKs抑制剂PP2(1.5μg)能够有效抑制Paxillin(Y118F)引起的痛觉超敏；(5)体外和体内实验都显示：Paxillin-Y118的去磷酸化,会打断Paxillin与Src的抑制蛋白CSK之间的相互作用,降低CSK的突触表达水平,这可能是Paxillin(Y118F)诱发Src依赖性GluN2B功能亢进的重要机制；(6)为验证这一假设,我们构建了野生型CSK[CSK(WT)]和无活性的CSK突变体CSK(K222R),并通过腺病毒表达载体、感染脊髓背角神经元,发现：正常动物表达CSK(K222R)也能够诱发明显的痛觉超敏,且这一作用可被GluN2B的选择性抑制剂ifenprodil (1.6μg)所阻断；(7)为探讨Paxillin在慢性炎性疼痛中的作用,我们使炎性疼痛动物过表达Paxillin(Y118E),发现：Paxillin(Y118E)能够重新升高CSK的突触表达水平,有效缓解慢性炎性疼痛症状。结论：外周组织损伤可引发Paxillin-Y118去磷酸化,打断Paxillin和CSK的分子结合,降低CSK的突触含量,从而解除CSK对Src的抑制性控制,导致Src的活化及其对GluN2B-Y1472的磷酸化；过表达Paxillin(Y118E)能够重新升高CSK的突触表达水平,有效缓解慢性炎性疼痛症状。
【关键词】：炎性疼痛 脊髓背角 N-甲基-D-天冬氨酸受体 Paxillin C-末端 Src激酶 Src
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 前言10-17
• 1.1 Paxillin的结构与功能11-12
• 1.2 NMDA受体与突触可塑性12-14
• 1.3 Src家族酪氨酸激酶(Src family tyrosine kinases)14-15
• 1.4 C-末端Src激酶(C-terminal Src kinase；CSK)15-17
• 第二章 实验材料和方法17-27
• 2.1 实验材料17-21
• 2.1.1 实验动物17
• 2.1.2 实验器材17-18
• 2.1.3 实验试剂18-20
• 2.1.4 溶液配制20-21
• 2.2 实验方法21-27
• 2.2.1 皮下给药21-22
• 2.2.2 鞘内给药22
• 2.2.3 行为学测试22
• 2.2.4 小鼠脊髓背角亚细胞结构的分离22-23
• 2.2.5 HEK293T细胞的培养、转染23
• 2.2.6 免疫蛋白印迹(Western Blot)23-24
• 2.2.7 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation;Co-IP)24-25
• 2.2.8 免疫组化(Immunohistochemistry;IHC)25
• 2.2.9 脊髓背角C-纤维诱发场电位的记录(C-fiber evoked field potential recordings)25-26
• 2.2.10 数据分析与统计(Data analysis and statistics)26-27
• 第三章 实验结果27-46
• 3.1 Paxillin在脊髓背角中的分布特征27-28
• 3.1.1 Paxillin分布于脊髓背角神经元27
• 3.1.2 Paxillin存在于脊髓背角神经元的突触后致密质(PSD)中27-28
• 3.2 突触活动和外周组织损伤调节Paxillin-Y118的磷酸化28-31
• 3.2.1 突触活动调节Paxillin-Y118磷酸化28-30
• 3.2.2 外周组织损伤下调Paxillin-Y118磷酸化30-31
• 3.3 Paxillin-Y118磷酸化的改变在痛觉传导中的作用31-33
• 3.3.1 Paxillin-Y118磷酸化的改变在痛觉超敏中的作用31-32
• 3.3.2 Paxillin-Y118磷酸化的改变影响C-纤维诱发场电位LTP幅度32-33
• 3.4 Paxillin通过SFKs及GluN2B受体调控痛觉传递33-37
• 3.4.1 Paxillin通过SFKs信号通路调节痛觉传递33-36
• 3.4.2 Paxillin-Y118去磷酸化增强GluN2B-Y1472的磷酸化36-37
• 3.5 Paxillin-Y118磷酸化调控Paxillin/CSK的结合及CSK突触表达37-42
• 3.5.1 CSK在脊髓背角中的分布37-38
• 3.5.2 Paxillin-Y118去磷酸化降低Paxillin/CSK的分子结合38-41
• 3.5.3 Paxillin-Y118去磷酸化降低CSK的突触表达41-42
• 3.6 CSK的痛觉调控作用42-43
• 3.7 Paxillin在慢性炎性疼痛中的作用43-46
• 3.7.1 Paxillin(Y118E)增加炎性动物CSK突触表达水平43-44
• 3.7.2 Paxillin(Y118E)缓解慢性炎性疼痛症状44-46
• 第四章 讨论46-52
• 4.1 NMDA受体在调节脊髓背角Paxillin-Y118磷酸化中的作用46-47
• 4.2 Paxillin-Y118去磷酸化可降低Paxillin/CSK的分子结合,降低CSK的突触表达,调控痛觉传递47-48
• 4.3 Paxillin调节痛觉传递和突触可塑性48-51
• 4.4 CSK的痛觉调控功能51-52
• 第五章 结论与展望52-53
• 5.1 结论52
• 5.2 展望52-53
• 缩略词53-55
• 参考文献55-61
• 在学期间研究成果61-62
• 致谢62

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